Investigação da deubiquitinase USP 2b como um possível estabilizador do receptor EGF

Abstract

Resumo: A degradação seletiva de muitas proteínas intracelulares é realizada pela via ubiquitina, responsável por mecanismos homeostáticos celulares como a regulação de vias de sinalização, endocitose e apoptose. Este processo é reversível e regulado negativamente pelas enzimas deubiquitinases (DUB), dentre as quais a família USP (ubiquitin specific protease) possui grande importância no papel funcional da proliferação e sobrevivência celular. Alterações na via ubiquitina são descritas em condições patológicas, devido a ocorrência de danos em proteínas celulares, acúmulo intracelular proteico e redução da atividade proteossômica, podendo resultar em supressão da apoptose e progressão descontrolada do ciclo celular e suas diversas sinalizações. Dentre as isoformas de USP2, a USP2a tem sido amplamente associada à patogenia de tumores, seja por sua interferência em proteínas do ciclo celular, oncoproteínas, e na via de degradação de receptores tirosina cinase, como o EGFR (receptor de fator de crescimento epidermal). Por outro lado, existem poucos estudos relacionados à caracterização de USP2b, que poderiam identificar sua possível inferência em processos patológicos. Deste modo, o objetivo foi construir ferramentas e estabelecer condições experimentais para a investigação bioquímica das deubiquitinases USP2a e USP2b. USP2b recombinante com cauda de histidina foi produzida em bactérias E. coli Rosetta2(DE3) pLysS e submetida a protocolos de purificação. Embora sem desfecho positivo na expressão da USP2b nas condições citadas, obteve-se com sucesso a expressão de USP2a e USP2b em células de mamíferos (HeLa/HEK293T) utilizando-se diferentes métodos de transfecção (lipofectamina e co-precipitação com cálcio), possibilitando a identificação de picos de expressão conforme a metodologia aplicada. Experimentos permitiram a identificação de USP2a endógena enriquecida na fração 30% de saturação de sulfato de amônio. Além disso, o anticorpo monoclonal anti-USP2a secretado pelo hibridoma 4GD2, previamente elaborado pelo grupo, permitiu a imunoprecipitação de USP2a tanto endogenamente expressa por células HeLa como superexpressa na linhagem HEK293T. Evidências experimentais obtidas neste trabalho sugerem que a USP2b tem a capacidade de estabilizar EGFR, de modo semelhante ao já descrito para a isoforma USP2a. Espera-se que os resultados gerados possam contribuir para o desenvolvimento de novas ferramentas terapêuticas e diagnósticas bem como no mecanismo de funcionamento destas deubiquitinases. Palavras-chave: Enzimas deubiquitinases. USP2. USP2a. USP2b. EGFR. EGF.

Abstract: Selective degradation of many intracellular proteins is performed by ubiquitin pathway, which is responsible for cellular homeostatic mechanisms, such as regulation of cellular signaling, endocytosis and apoptosis. Ubiquitylating modification is reversible, negatively regulated by deubiquitinases enzymes (DUB), among which the USP family (ubiquitin specific protease) has great importance in the functional role of cell proliferation and survival. Disturbance on ubiquitin pathway are described under pathological conditions, due to cellular proteins damage, intracellular protein accumulation and reduction of proteasomic activity, may causing apoptosis suppression, and uncontrolled cell cycle and its several signals. Amog USP2 isoforms, USP2a has been widely associated in tumor pathogenesis, whether by their interference with cell cycle proteins, oncoproteins, and on tyrosine kinase receptor degradation pathway, such as EGFR (epidermal growth factor receptor). Meanwhile, there are few studies on USP2b characterization, that could recognize its possible inference in pathological processes. Therefore, the aim of this study was to create tools and establish experimental conditions for deubiquitinases USP2a and USP2b biochemical investigation. Recombinant USP2b with histidine tail was produced in E. coli Rosetta2(DE3) pLysS bacteria for purification protocols, however, not resulting on the expected expression. USP2a and USP2b expression in mammalian cells (HeLa/HEK293T) was successfully obtained by different transfection methods (lipofectamine and calcium co-precipitation), enabling identification of expression peaks according to the methodology applied. Experiments allowed identification of endogenous USP2a enriched in the fraction of 30% ammonium sulfate saturation. Also, anti-USP2a monoclonal antibody secreted by 4GD2 hybridoma, previously obtained by the group, allowed USP2a immunoprecipitation at HeLa cells endogenously expression, and on HEK293T at overexpression conditions. Experimental evidences of this study suggest that UPS2b has the ability to stabilize EGFR, in a similiar manner already described in USP2a isoform. The obtained results are expected to contribute to new therapeutic and diagnostic tools development, as well as the functioning mechanism of these deubiquitinases. Keywords: Deubiquitinases enzymes. USP2. USP2a. USP2b. EGFR. EGF.