Relação da vimentina e autofagia com a morte de células Melan-A e B16-F10 tratadas com RBAc-PDT

Abstract

Resumo: O câncer de pele do tipo melanoma apresenta alta taxa de mortalidade e baixa resposta frente aos tratamentos atualmente disponíveis. Desta forma, estudos procuram compreender melhor os mecanismos celulares envolvidos na resistência e na elevada agressividade das células de melanoma para desenvolver novas estratégias terapêuticas. A terapia fotodinâmica (PDT) envolve a geração de oxigênio molecular singlete (1O2) por um fotossensibilizador (PS) irradiado com luz em um comprimento de onda específico, desencadeando respostas celulares que podem levar à destruição do tumor. Entretanto, a efetividade da PDT em melanomas é baixa. Anteriormente, foi mostrado usando análise proteômica, que os níveis de vimentina eram alterados em melanócitos e células de melanoma tratadas com 1O2. A vimentina é uma proteína do citoesqueleto que é geralmente superexpressa em carcinomas e parece estar relacionada com o crescimento e a metástase de tumores. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi melhor entender a influência da vimentina no processo de morte celular em melanócitos (Melan-A) e células de melanoma (B16-F10) após o tratamento com 1O2 gerado pela PDT, usando como PS o Rosa Bengala Acetato (RBAc). A viabilidade foi avaliada pela metabolização do MTT, pela marcação com cristal violeta (CVS) e pela captação de vermelho neutro (NRU). Os resultados mostraram que ambas as linhagens apresentaram uma diminuição da viabilidade (MTT e CVS) com 5,0 ?g.mL-1 de RBAc, 18 horas após terem sido irradiadas com LED (526 nm; 1,5 J/cm2). A análise pelo método NRU mostrou um efeito inverso aos resultados do CVS e MTT; esse padrão é um forte indicativo de morte das células por autofagia. Para confirmar, foi analisada a expressão de proteínas relacionadas ao processo autofágico, Beclin-1 e LC3 por western blotting. Em ambas as linhagens celulares, a PDT promoveu diminuição dos níveis de Beclin-1 e da relação LC3 II/LC3 I na análise feita imediatamente ao término da irradiação. Após 18 horas, o nível de Beclin-1 foi restaurado e houve um aumento na relação LC3 II/LC3 I em ambas as linhagens. Em B16-F10, o efeito da PDT ocasionou aumento na relação vimentina fosforilada na serina 56/vimentina, 18 horas após a PDT. No caso das células Melan-a, não tivemos variação na relação vimentina fosforilada serina 56/vimentina, mostrando que essas duas linhagens tem alterações diferentes no citoesqueleto após a PDT. No presente estudo, nós demonstramos a indução de autofagia após 18h de RBAc-PDT em melanoma e melanócitos. Mostramos ainda que ambas as linhagens celulares têm diferentes alterações na expressão de proteínas relacionadas à autofagia e citoesqueleto e que existem diferenças quando a análise é feita imediatamente após a PDT ou 18h depois. Desta forma, este estudo proporciona uma melhor compreensão da relação da morte celular com alterações de proteínas do citoesqueleto após PDT em melanócitos e células de melanoma. Palavras-chave: melanoma, fosforilação, rosa bengala, terapia fotodinâmica e vimentina.

Abstract: Melanoma is a type of skin cancer with high mortality rate and low response to the currently available treatments. Thus, studies look for a better understanding about the cellular mechanisms involved in resistance and high aggressiveness of melanoma cells in order to develop new therapeutic strategies. Photodynamic therapy (PDT) involves the generation of singlet molecular oxygen (1O2) when a photosensitizer (PS) is irradiated with light in a specific wavelength which triggers cellular responses that can lead to tumor destruction. However, the effectiveness of PDT in melanomas is low. Previously, proteomic analysis, showed that vimentin levels were altered in melanocytes and melanoma cells treated with 1O2. Vimentin is a cytoskeletal protein that is overexpressed in cancers and generally appears to be related to the growth and metastasis of tumors. Thus, the main objective of this study is the investigation about the influence of vimentin in the process of cell death in melanocytes (Melan-a) and melanoma cells (B16-F10) after treatment with 1O2 generated by PDT, using Rose Bengal Acetate (RBAc) as PS. The viability was assessed by MTT metabolism, by crystal violet (CVS) labeling and neutral red uptake (NRU). The results showed that both cell lines showed reduced viability (MTT and CVS) with 5.0 ?g.mL-1 RBAc, 18 hours after being irradiated with LED (526 nm, 1.5 J/cm2). The NRU analysis showed an inverse effect to the CVS and MTT results; this pattern is a strong indicator of cell death by autophagy. To confirm, we analyzed the expression of proteins related to autophagic process, beclin-1 and LC3 by western blotting. In both cell lines, PDT caused a reduction of beclin-1 levels and in the relation LC3 II/ LC3 I in the analysis performed immediately at the end of irradiation. After 18 hours, the level of beclin-1 was restored and an increase in the relation LC3 II/LC3 I was observed in both cell lines. To B16-F10, the effect of PDT resulted in an increase in the relation vimentin phosphorylated at serine 56/vimentin, 18 hours after PDT. For Melan-a cells, no variation in the relation vimentin phosphorylated serine 56/vimentin was observed, indicating that these two cell lines have different alterations in the cytoskeleton after PDT. In the present study, we demonstrated the induction of autophagy after 18h of RBAc-PDT in melanoma and melanocytes. We also show that both cell lines have different changes in protein expression related to autophagy and cytoskeleton and that there are differences when the analysis is done immediately after PDT or 18h later. Thus, this study provides a better understanding of cell death related proteins cytoskeletal changes after PDT in melanocytes and melanoma cells. Keywords: melanoma, phosphorylation, photodynamic therapy, rose bengal, vimentin.