Otimização da produção de amilases de Coprinus comatus em cultivo submerso utilizando subprodutos de moagem do trigo : obtenção dos parâmetros cinéticos do bioprocesso

Abstract

Resumo: As amilases são enzimas que catalisam a hidrólise do amido e são obtidas industrialmente de fontes microbianas. Os custos de meios de cultivo e do processo para produção de enzimas, no entanto, podem ser elevados e inviabilizar a sua utilização. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial de utilização de subprodutos de moagem do trigo para produção de amilases de uma cepa de macromiceto, Coprinus comatus, por cultivo submerso. Os melhores resultados de atividade enzimática (6,07 U.mL-1 para ?-amilase e 0,64 U.mL-1 para glucoamilases) foram obtidos em meio contendo 10 g.L-1 de farinha de fundo de moinho (FFM). A FFM foi selecionada como substrato para etapas posteriores, em que foram avaliadas a influência da suplementação e do pH inicial do meio de cultivo na produção das amilases. A composição do meio de cultivo foi otimizada utilizandose um Planejamento Fatorial Fracionado e um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR). O Planejamento Fatorial Fracionado selecionou como variáveis significativas a concentração de FFM, ureia e K2HPO4, que foram otimizadas por meio do DCCR. As atividades enzimáticas obtidas no meio ótimo (composto de 105 g.L-1 de FFM, 3,761 g.L-1 de ureia e 7,522 g.L-1 de K2HPO4) foram de 59,40±0,56 U.mL-1 e 12,65±0,09 U.mL-1 para ?- amilases e glucoamilases, respectivamente, o que representa um aumento de 878% e 1877% da produção enzimática inicial. Durante o estudo cinético do bioprocesso, as atividades enzimáticas obtidas foram ainda superiores aos da etapa de otimização, em tempos mais prolongados de cultivo, chegando a de 62,7 U.mL-1 em 144h para ?-amilase e 15,20 U.mL-1 em 204h para glucoamilase. A velocidade específica de crescimento de C. comatus no meio de cultivo otimizado (?máx) foi de 0,018 h-1 e tempo de duplicação (td) de 38,61h. A utilização do meio FFM propicia produtividade horária máxima (?pmáx) para ?-amilase de 0,59 U.mL-1.h-1e para glucoamilase de 0,11 U.mL-1.h-1. Os fatores de conversão de substrato em produto (YP/S) obtidos foram de 814,28 U.gds-1 para ?-amilase e 231,24 U.gds-1 para glucoamilase, superiores aos resultados obtidos em estudos anteriores utilizando meio sintético. Isto indica que a utilização do meio FFM desenvolvido no presente trabalho representa uma alternativa de baixo custo para a produção de amilases pela espécie estudada. Por fim, a caracterização das enzimas parcialmente purificadas revelou um perfil semelhante ao de diversas amilases de origem fúngica (temperatura ótima de atuação de 50°C e pH 5,0), além da independência do íon cálcio, o que possibilita aplicação em diversos processos industriais. Palavras-chave: Macromicetos. ?-amilases. Glucoamilase. Resíduos. Otimização.

Abstract: Amylases are enzymes that catalyze the hydrolysis of starch and are obtained industrially from microbial sources. The costs of culture media and the process for producing enzymes, however, can be high and make their use unfeasible. In this context, the present study aimed to evaluate the potential of using wheat milling by-products to produce amylases from a macromycete strain, Coprinus comatus, under submerged culture. The best results of enzymatic activity (6.07 U.mL-1 for ?-amylase and 0.64 U.mL-1 for glucoamylases) were obtained in medium containing 10 g.L-1 of Low-Grade Flour (LGF). LGF was selected as substrate for sequential steps of amylases production, in which the influence of supplementation and the initial pH of the culture medium on the production of amylases were evaluated. The composition of the culture medium was optimized using a Fractional Factorial Design and a Central Composite Rotatable Design (CCRD). The Fractional Factorial Design selected as significant variables the concentration of LGF, urea and K2HPO4, which were optimized by means of CCRD. The enzymatic activities obtained in the optimum medium (composed of 105 g.L-1 of FFM, 3,761 g.L-1 of urea and 7,522 g.L-1 of K2HPO4) were 59.40 ± 0.56 U.mL-1 and 12.65 ± 0.09 U.mL-1 for ?-amylases and glucoamylases, respectively, representing an increase of 878% and 1877% of the initial enzyme production. During the kinetic study of the bioprocess, the enzymatic activities obtained were even higher than those obtained on the optimization step, in longer cultivation times, reaching 62.7 U.mL-1 in 144h for ?-amylase and 15.20 U.mL-1 in 204h for glucoamylase. The specific growth rate of C. comatus in the optimized culture medium (?max) was 0.018 h-1 and the duplication time (td) was 38.61 h. The use of the LGF medium provides a maximum hourly productivity (?pmáx) for ?-amylase of 0.59 U.mL-1.h- 1 and for glucoamylase of 0.11 U.mL-1.h-1. The product formation yield on substrate consumed (YP/S) obtained were 814.28 U.gds-1 for ?-amylase and 231.24 U.gds-1 for glucoamylase, higher than the results obtained in previous studies using synthetic medium. This indicates that the use of the LGF medium developed in the present study represents a low cost alternative for the production of amylases by the species studied. Finally, the characterization of the partially purified enzymes revealed a profile similar to that of several amylases of fungal origin (optimum temperature of 50°C and pH 5.0), besides the independence of the calcium ion, which allows application in several industrial processes. Keywords: Macromycetes. ?-amylase. Glucoamylase. By-products. Optimization.