Prospecção e caracterização de antígenos miméticos de aflatoxina obtidos por phage display com validação do potencial imunogênico

Abstract

Resumo: A aflatoxina é um metabólito fúngico que compromete a saúde pública e a produção animal, causando doença hepática severa, neoplasias e perdas econômicas. Por ser um hapteno, é incapaz de induzir resposta imune efetiva e produção de anticorpos anti-aflatoxina, exceto se conjugada a proteínas carreadoras. Buscando a substituição desses conjugados de toxinas como imunógenos, esse trabalho prospectou antígenos que mimetizam a aflatoxina, por meio da técnica de phage display. Nessa técnica, um anticorpo pode ser empregado como molécula alvo para a biosseleção in vitro, visando à obtenção de peptídeos que se ligam especificamente à região variável do anticorpo e que mimetizam o antígeno nativo. Dessa forma, bacteriófagos que se ligam in vitro ao anticorpo anti-aflatoxina podem ser selecionados para a obtenção de versões sintéticas de vacinas capazes de induzir resposta imune contra a aflatoxina. Assim, os objetivos do presente trabalho foram selecionar clones de fagos altamente reativos miméticos de aflatoxina B1, buscando o desenvolvimento de imunógenos capazes de induzir a produção de anticorpos anti-aflatoxina. As adequações da técnica de phage display previamente estabelecida permitiram a prospecção dos clones miméticos de aflatoxina 3P8, 3P13, 3P16, 3P20, 3P23 e 3P30 que foram ligantes de anticorpo comercial monoclonal anti-AFB1. Os resultados dos imunoensaios executados indicaram a alta especificidade de peptídeos expressos por esses fagos em mimetizar in vitro as características imunológicas correspondentes à AFB1 em anticorpo específico anti-AFB1. Desta forma, foi observado que a reatividade do fago com o anticorpo foi dependente das concentrações de fago estabelecidas, assim como não houve reatividade frente a moléculas irrelevantes. Fagos expressando mimotopos de baixa reatividade (como o fago 3P25 e o fago silvestre) não foram capazes de estabelecer esta condição, indicando que os mimotopos selecionados corresponderam complementarmente ao sítio de ligação ao antígeno em anticorpo anti-AFB1. A partir da sequência aminoacídica obtida dos mimotopos selecionados, QTDLDYLHPLINSWN, o peptídeo mimético de aflatoxina foi sintetizado e conjugado à molécula carreadora para validação do potencial imunogênico. O resultado das estratégias de imunização com mimotopos e peptídeo sintético indicou que os imunógenos foram eficientes na indução de anticorpo anti-peptídeo que também foi capaz de reconhecer o antígeno original. Portanto, o mimetismo molecular do peptídeo selecionado por phage display foi confirmado, permitindo o emprego do fago como imunógeno para o desenvolvimento de uma vacina de subunidades, por meio do encapsulamento em nanopartículas de quitosana. As nanopartículas de quitosana-bacteriófago proporcionaram melhoria na resposta imune específica e local quando comparada a fagos não recobertos. Portanto, o biopolímero permitiu a administração intranasal do imunógeno e o reconhecimento do antígeno pelo sistema imune de mucosa, configurando uma plataforma eficiente na indução de anticorpos específicos anti-aflatoxina. A proposta desse modelo vacinal para o controle de micotoxinas constitui uma nova linha de pesquisa na medicina veterinária e uma alternativa para o desenvolvimento da produção animal. Posteriormente, esta abordagem racional poderá ser aplicada a outras micotoxinas que afetam as populações humana e animal. Palavras-chave: AFB1. Aflatoxicose. Peptídeo. Mimotopo. Imunógeno. Vacinação.

Abstract: Aflatoxin is a fungal metabolite that compromises public health and animal production, causing severe liver disease, cancer and economic losses. Because it is a hapten, it is incapable of inducing effective immune response and production of anti-aflatoxin antibodies, unless conjugated to carrier proteins. Seeking the replacement of these conjugates of toxins as immunogens, this work prospected for antigens that mimic aflatoxin, using the phage display technique. In this technique, an antibody can be employed as a target molecule for in vitro bioselection, in order to obtain peptides that bind specifically to the variable region of the antibody and mimic the native antigen. Thus, bacteriophages that bind in vitro to the anti-aflatoxin antibody can be selected to obtain synthetic versions of vaccines capable of inducing an immune response against aflatoxin. Thus, the objectives of the present work were to select highly reactive mimetic phages of aflatoxin B1, seeking the development of immunogens capable of inducing the production of anti-aflatoxin antibodies. The adequacy of the previously established phage display technique allowed the prospection of aflatoxin 3P8, 3P13, 3P16, 3P20, 3P23, and 3P30 mimetic clones that were binder of commercial anti-AFB1 monoclonal antibody. The results of the immunoassays performed indicated the high specificity of peptides expressed by these phages in mimicking in vitro the immunological characteristics corresponding to AFB1 in specific anti-AFB1 antibody. Thus, it was observed that the reactivity of the phage against the antibody was dependent on the established phage concentrations, just as there was no reactivity to irrelevant molecules. Phages expressing low reactivity mimotopes (such as 3P25 phage and wild-type phage) were unable to establish this condition, indicating that the selected mimotopes corresponded complementary to the antigen-binding site in anti-AFB1 antibody. From the amino acid sequence obtained from the selected mimotopes, QTDLDYLHPLINSWN, the aflatoxin mimetic peptide was synthesized and conjugated to the carrier molecule to validate the immunogenic potential. The results of mimotope and synthetic peptide immunization strategies indicated that the immunogens were efficient in inducing anti-peptide antibody that was also able to recognize the original antigen. Therefore, the molecular mimicry of the peptide selected by phage display was confirmed, allowing the use of the phage as an immunogen for the development of a subunit vaccine, through the encapsulation in chitosan nanoparticles. Chitosan-bacteriophage nanoparticles provided improved local and specific immune response when compared to uncoated phages. Therefore, the biopolymer allowed the intranasal administration of the immunogen and the recognition of the antigen by the mucosal immune system, configuring an efficient platform in the induction of specific anti-aflatoxin antibodies. The proposal of this vaccine model for the control of mycotoxins constitutes a new line of research in veterinary medicine and an alternative for the development of animal production. Subsequently, this rational approach could be applied to other mycotoxins that affect human and animal populations. Keywords: AFB1. Aflatoxicosis. Peptide. Mimotope. Immunogen. Vaccination.