Caracterização estrutural dos fatores de iniciação da tradução EIF4E de Trypanossoma cruzi e análise de interações com a TcEIF4G5 e análogos do cap do mRNA

Abstract

Resumo: A Doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, mesmo mais de um século depois de sua descrição ainda é um problema atual de saúde pública. Não há vacina contra a doença e acredita-se que o tratamento existente seja realmente eficiente apenas para a fase aguda, tendo sido relacionado com graves efeitos colaterais. Buscando assim maior seletividade, o desenvolvimento de novos compostos visando terapias para a Doença de Chagas tem focado na identificação de mecanismos moleculares únicos no parasita em relação ao seu hospedeiro mamífero. Dentre as características singulares a tripanossomatídeos destacam-se algumas relacionadas à maquinaria de tradução, como a estrutura diferenciada de cap do mRNA, o cap4, e a presença de um grande número de homólogas de fatores de iniciação da tradução, dentre eles a proteína ligadora de cap eIF4E. As interações entre os fatores de iniciação de tradução dos tripanossomatídeos também apresentam especificidades, como, por exemplo, a interação realizada por diferentes EIF4E com os fatores EIF4G para a formação de complexos EIF4F-like. Neste contexto, o projeto teve como objetivo a análise de interações realizadas pelos fatores EIF4E de T. cruzi (TcEIF4E) com análogos do cap do mRNA e entre os fatores TcEIF4E5 e TcEIF4G5, e assim a caracterização de uma interação espécie-específica. As homólogas TcEIF4E1 e 5 foram produzidas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia. Formas truncadas recombinantes da TcEIF4G5 foram também produzidas, purificadas e submetidas a ensaios de interação com a TcEIF4E5. A interação direta entre TcEIF4E5-TcEIF4G5 foi demonstrada através da técnica de termoforese em microescala, determinando-se que a interação envolve a região N-terminal da TcEIF4G5. Visando a determinação da estrutura cristalográfica o homólogo TcEIF4E5 foi cristalizado em presença de análogos cap. O domínio MIF da TcIF4G5 também foi cristalizado. Análises de modelagem estrutural das homólogas TcEIF4E indicam a presença de modificações importantes em regiões chave para a interação entre tais proteínas e a estrutura do cap do mRNA, sugerindo que as TcEIF4E possuem funcionalidades distintas no maquinário de iniciação de tradução. Palavras-chave: Tripanossomatídeos. Fatores de iniciação da tradução. Interações moleculares. Análises estruturais.

Abstract : Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi, remains a public health problem, over a century since the disease discovery. There is no approved vaccine and the existing treatment is thought to be effective only for the acute phase besides being associated to severe side effects. In the search for higher selectivity, the development of novel compounds aiming Chagas disease therapy have focused on molecular mechanisms that are unique to the parasite. Among the features specific to trypanosomatids that stand out, some belong to the translational machinery, such as the mRNA cap-4 structure, a larger number of genes encoding translation initiation factors, including the putative cap-binding proteins (EIF4E). Some interactions between trypanosomatids translation initiation factors are also specific as for example interactions between different EIF4E and EIF4G homologs. In this context, this project was started with the objective to investigate the interactions between T. cruzi IF4E (TcEIF4E) homologs with mRNA-cap analogs and between the translation factors TcIF4E5 and TcEIF4G5. The translation factors TcEIF4E1 and TcEIF4E5 homologs were expressed in Escherichia coli and purified by chromatography. Truncated derivatives of TcIF4G5 were also obtained after recombinant expression in E. coli and used in interaction assays with recombinant TcEIF4E5. Direct interaction between TcEIF4E5 e TcEIF4G5 was determined using microscale thermophoresis. This interaction was mapped to the N-terminal region of TcEIF4G5. TcEIF4E5 was successfully crystallized in the presence of cap analogs. Crystallization was also performed with the MIF domain of TcEIF4G5. Analysis of structural models constructed by homology indicate that TcEIF4E isoforms possess important modifications in the regions that interact with the mRNA cap structure, suggesting that they can play distinct roles in translation initiation. Key-words: Trypanosoma cruzi. Translation initiation factors. Molecular interactions. Structural analysis.