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dc.contributor.advisorSantos, Marcelo Muller dospt_BR
dc.contributor.authorAlves, Luis Paulo Silveirapt_BR
dc.contributor.otherChubatsu, Leda Satie, 1966-pt_BR
dc.contributor.otherValdameri, Glauciopt_BR
dc.contributor.otherUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)pt_BR
dc.date.accessioned2018-11-28T20:23:41Z
dc.date.available2018-11-28T20:23:41Z
dc.date.issued2018pt_BR
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/1884/55814
dc.descriptionOrientador: Prof. Dr. Marcelo Müller dos Santospt_BR
dc.descriptionCoorientadores: Profª Drª Leda Satie Chubatsu, Prof. Dr. Glaúcio Valdameript_BR
dc.descriptionTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica) . Defesa : Curitiba, 26/03/2018pt_BR
dc.descriptionInclui referências: p.158-178pt_BR
dc.description.abstractResumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria fixadora de nitrogênio, endofítica, promotora de crescimento vegetal e produtora de um polímero estocado internamente, denominado polihidroxibutirato (PHB). O PHB é produzido a partir da condensação de monômeros de ácido 3-hidroxibutírico e estocado na forma de grânulos insolúveis. Bactérias acumulam maior quantidade de PHB, geralmente, em situações de excesso de carbono ou falta de algum outro nutriente essencial como fosfato e nitrogênio. O PHB estocado pode ser utilizado como uma reserva energética, sendo mobilizado quando a bactéria se encontra em situações de estresse. A superfície dos grânulos de PHB é revestida por várias proteínas, principalmente aquelas envolvidas na síntese e na degradação do polímero. As proteínas de superfície mais abundantes são as fasinas, que têm um papel fundamental na manutenção do número e do tamanho dos grânulos no interior da célula. Além das fasinas, PHA sintases, PHA depolimerases e o regulador transcricional PhaR também são encontrados associados à superfície. Recentemente, o papel do PHB na interação planta-bactéria passou a ser novamente discutido, devido a alguns microrganismos mobilizarem os grânulos de PHB como forma de defesa antioxidante durante a colonização de raízes de plantas. Além disso, dados de análise transcriptômica apontam que a síntese e a degradação de PHB podem ocorrer durante a colonização de plantas por H. seropedicae e Azospirillum brasilense. Sendo assim, nesse trabalho de tese objetivou-se avançar no entendimento do papel do PHB para a proteção de H. seropedicae contra o estresse celular e para a colonização de plantas. Nessa tese serão apresentados resultados relacionados a (i) uma metodologia criada para uma rápida quantificação de PHB através da técnica de citometria de fluxo, (ii) a influência das fasinas na produção de PHB em H. seropedicae, (iii) o papel do PHB frente a diferentes tipos de estresse in vitro e (iv) a relevância do PHB durante o processo de colonização de plantas. Os resultados do Capítulo 1 mostram que é possível substituir a técnica laboriosa de quantificação de PHB baseada em metanólise e cromatografia a gás pela citometria de fluxo de células coradas com Vermelho Nilo. Desta forma o processo de quantificação de PHB pode ser realizado em intervalos curtos de 5 min, além de permitir a quantificação de concentrações diminutas do polímero, requerendo poucas células. Tal metodologia é de extrema importância para se determinar a quantidade de PHB em populações de bactérias colonizando a superfície de raízes, o que seria inviável utilizando a metodologia por cromatografia a gás devido ao grande número de plantas necessárias para se obter a quantidade de biomassa bacteriana necessária. No Capítulo 2, demonstrou-se o papel das fasinas para a síntese de PHB e a importância da redundância genética entre os genes phaP1 e phaP2, assegurando a síntese de PHB e o fitness de H. seropedicae. No Capítulo 3, os resultados mostram que durante o choque térmico, tanto a síntese quanto a degradação do polímero são importantes para a sobrevivência da bactéria. Sendo que, as bactérias que não produzem o grânulo possuem uma taxa de sobrevivência muito menor comparado à estirpe selvagem e o mesmo ocorre com as estirpes que não conseguem mobilizar os grânulos durante o estresse. No Capítulo 4, apresentam-se resultados que demonstram a importância do metabolismo de PHB para o processo de colonização de plantas pela bactéria H. seropedicae SmR1. Realizou-se ensaios de interação planta-bactéria utilizando as estirpes mutantes defectivas na produção e degradação do polímero, e novamente foram observados resultados significativos quanto ao desenvolvimento das raízes de plantas inoculadas, assim como uma significativa redução da população endofítica das bactérias incapazes de produzir ou degradar PHB adequadamente. Palavras-chave: Herbaspirillum seropedicae, polihidroxibutirato, fasinas, interação planta-bactéria, citometria de fluxo.pt_BR
dc.description.abstractAbstract: Herbaspirillum seropedicae is a nitrogen-fixing, endophytic, plant growth promoter and producer of an internally stored polymer, called polyhydroxybutyrate (PHB). This polymer is produced by the condensation of monomers of 3- hydroxybutyric acid and stored as insoluble granules. Bacteria accumulate more PHB in situations of excess carbon or lack of some other essential nutrients like phosphate and nitrogen. In this way, PHB can be used as an energy reserve and mobilized when the bacteria are in a stressful situation. On the surface of the PHB granules, there are many proteins involved in the synthesis and degradation of the polymer. The most abundant are the phasins, which play a key role in maintaining the number and size of the granules inside the cell. In addition to the phasins, PHA synthases, PHA depolymerases and the transcriptional regulator PhaR are also found associated with the surface. Recently, the role of PHB in plant-bacteria interaction has been actively discussed, because some bacteria mobilize PHB granules as a form of antioxidant defense during the colonization of plant roots. Also, data from transcriptomic analysis indicate that the synthesis and degradation of the PHB occur during the colonization of plants by H. seropedicae and Azospirillum brasilense. Thus, the objective of this thesis was to advance the understanding of the role of the PHB protecting H. seropedicae against stressful conditions and for the colonization of plants. This thesis will present results related to (i) the methodology established for a rapid quantification of PHB through the flow cytometry technique, (ii) the influence of the phasins on PHB production in H. seropedicae, (iii) the protecting role of PHB against different types of stress in H. seropedicae and (iv) the relevance of the polymer during the plant colonization process. The results of Chapter 1 showed that it is possible to replace the labour-intensive technique of quantification of PHB based on methanolysis and gas chromatography by flow cytometry of cells stained with Nile Red. In this way, the PHB quantification process can be performed at 5-min intervals, whilst allowing the quantification of PHB at low concentrations and applying a few number of cells. Such methodology is critical to determine the amount of PHB in bacterial populations colonising the root surface, which would be impracticable using the methodology by gas chromatography due to the high biomass content required (~ 5 mg of liophylized bacteria). In Chapter 2, the role of phasins for PHB synthesis and the importance of genetic redundancy between phaP1 and phaP2 genes were demonstrated, ensuring PHB synthesis and the fitness of H. seropedicae SmR1. In Chapter 3, the results show that during thermal shock, both the synthesis and the degradation of the polymer are essential for the survival of the bacterium. The bacteria that do not produce the granule have a much lower survival rate than the wildtype strain, and so do the strains that cannot mobilise the granules during stress. In Chapter 4, we present results that demonstrate the importance of PHB metabolism for the process of colonization of plants by H. seropedicae SmR1. Plantbacteria colonization assays were performed using mutants defective in the production and degradation of the polymer, and again significative results were determined for PHB-producing strains on the development of inoculated plant roots, while a significative reduction in the endophytic population of bacteria unable to produce or degrade PHB properly. Keywords: Herbaspirillum seropedicae, polyhydroxybutyrate, phasin, plant-bacteria interaction, flow cytometry.pt_BR
dc.format.extent178 p. : il. (algumas color.).pt_BR
dc.format.mimetypeapplication/pdfpt_BR
dc.languagePortuguêspt_BR
dc.subjectBactériaspt_BR
dc.subjectBioquímicapt_BR
dc.subjectCitometria de fluxopt_BR
dc.subjectPlantaspt_BR
dc.titleInvestigação do papel do metabolismo de polihidroxibutirato na resposta anti-estresse e na colonização de plantas em Herbaspirillum seropedicae SmR1pt_BR
dc.typeTese Digitalpt_BR


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