Caracterização de uma fosforribohidrolase do tipo lonely guy de Azospirillum brasilense, com uma possível ação na biossíntese de citocininas

Abstract

Resumo: O gene "LONELY GUY" (LOG) de Arabidopsis thaliana codifica uma das enzimas associadas à biossíntese de citocininas. As citocininas são fito-hormônios reguladores do crescimento e desenvolvimentos de plantas. Por meio de ferramentas de bioinformática foram encontrados dois genes homólogos a LOG de Arabidopsis thaliana no genoma de Azospirillum brasilense FP2. A. brasilense é uma bactéria associativa de plantas, fixadora de nitrogênio e promotora de crescimento vegetal. A produção de fito-hormônios, entre eles as citocininas, está ligada a capacidade de promover o crescimento vegetal através da inoculação com bactérias. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi caracterizar as proteínas Log1 e Log2 de A. brasilense. Os genes log1 e log2 foram amplificados através de reação em cadeia da polimerase (PCR). Os produtos de PCR foram clonados no plasmídeo pBlueScript II KS, sequenciados para confirmar a integridade da sequência de bases e subclonados nos plasmídeos pET28a e pET29a para expressão em E. coli BL21(DE3). As enzimas superexpressas com cauda de histidinas N-terminal ou C-terminal foram purificadas por cromatografia de afinidade a Ni2+. Os ensaios de atividade enzimática revelaram que ambas as enzimas possuem atividade fosforribohidrolase, ou seja, clivam a ligação N-glicosídica entre a adenina e a fosforribose quando o AMP foi utilizado como substrato. Outros ensaios revelaram que a presença de fosfato ligado a posição 5' da ribose foi importante para a atividade das enzimas Log1 e Log2, já que não foi detectada atividade contra adenosina. A descoberta de enzimas homólogas as LOGs anteriormente descritas em plantas, tais como A. thaliana, contribuirá para o desenvolvimento de linhagens de bactérias que produzam quantidades elevadas de citocininas. Especificamente no caso de A. brasilense tal característica poderia ser utilizada para gerar estirpes mais eficientes no processo de promoção do crescimento vegetal. Palavra-chave: Citocininas, Azospirillum brasilense, fosforribohidrolases.

Abstract: The LONELY GUY gene (LOG) of Arabidopsis thaliana codes one of the enzymes associated with cytokinin biosynthesis. Cytokinins are phytohormones that regulate growth and development of plants. Azospirillum brasilense FP2 has two genes homologous to LOG of A. thaliana as revealed by genome searching through computational analysis with amino acid sequences of LOGs previously described. A. brasilense is a plant associate bacterium, nitrogen-fixing and plant growth promoter. The production of phytohormones, among them cytokinins, is linked to the ability to promote plant growth through inoculation with bacteria. Thus, the objective of this work was to characterise the A. brasilense Log1 and Log2 enzymes. The log1 and log2 genes were amplified by polymerase chain reaction (PCR). The PCR products were cloned into the plasmid pBlueScript II KS, sequenced to confirm their integrities and subcloned into plasmids pET28a and pET29a for expression in E. coli BL21 (DE3). The enzymes were over-expressed with an N-terminal or C-terminal six histidines-tag and were purified by Ni2+ affinity chromatography. Enzyme activity assays revealed that both enzymes have phosphoribohydrolase activity since they cleave the N-glycosidic bond between adenine and phosphoribose when AMP was used as the substrate. Other assays showed that the presence of a phosphate group bound to the 5'-carbon of ribose was essential for the activity of Log1 and Log2 enzymes since they did not cleave adenosine. The discovery of homologous enzymes to the LOGs previously described in plants, such as A. thaliana, will contribute to the development of lineages of bacteria that produce high amounts of cytokinins. Specifically, in the case of A. brasilense, this characteristic could be used to generate more efficient strains in the process of promoting plant growth. Keywords: Cytokinin, Azospirillum brasilense, phytohormones