Detecção de colônias pequenas variantes de Staphylococcus aureus em amostras respiratórias de pacientes com fibrose cística

Abstract

Resumo: Em pacientes com fibrose cística (FC) ocorre a produção de secreção respiratória viscosa, que aumenta a probabilidade de infecções bacterianas. Staphylococcus aureus é o primeiro patógeno capaz de colonizar e promover infecções nas vias aéreas nestes pacientes. Variantes de colônias pequenas (SCVs) têm surgido em S. aureus relacionadas a infecções crônicas e recorrentes. SCVs são um desafio para o laboratório, principalmente porque são mutantes auxotróficos, que necessitam de substratos específicos para seu crescimento. Os objetivos deste trabalho foram avaliar as técnicas de diagnóstico para a detecção das colônias pequenas variantes de S. aureus (SCVs) em infecções pulmonares de pacientes com Fibrose Cística, atendidos nos ambulatórios do HC-UFPR, assim como determinar a prevalência deste fenótipo e o melhor método para a detecção da suscetibilidade aos agentes antimicrobianos. Foram coletadas e semeadas em Ágar Manitol, amostras respiratórias de 246 pacientes com FC atendidos entre 2014 e 2016. Colônias pequenas suspeitas de SCVs foram identificadas usando ágar com 7,5% de NaCl, teste da catalase e da coagulase, painel de identificação do Vitek®2 Compact, MALDI-TOF MS (Vitek® MS - bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) e PCR para o gene nuc. Foi determinada a dependência nutricional à hemina, menadiona ou timidina em Mueller Hinton Agar (MHA) por dois métodos: 1) MHA suplementado com estes substratos antes da semeadura e, 2) adição de discos contendo estes substratos sobre a superfície do MHA previamente semeado. O teste de suscetibilidade antimicrobiana foi realizado por disco difusão e microdiluição em caldo, e os meios utilizados nos testes foram suplementados com timidina. Determinantes de resistência aos beta-lactâmicos e macrolídeos foram pesquisados por PCR. Dos 246 pacientes, S. aureus foi isolado em 182 (74%) pacientes. SCVs foram isolados em 11pacientes (4,5%) e todos foram timidina-dependentes. O antibiograma demonstrou que 91% dos isolados eram resistentes a múltiplos fármacos, 9% eram resistentes à oxacilina (MRSA) e rifampicina, e todos eram suscetíveis à vancomicina e linezolida. Os genes mecA (1), ermA (1), ermB (1), ermC (2) e msrB (11) foram encontrados entre os isolados. Esta pesquisa indica um alerta para os microbiologistas sobre a dificuldade no reconhecimento e identificação de SCVs de S. aureus na rotina laboratorial. Além disso, mostra uma preocupação com o tratamento, uma vez que a maioria dos isolados demonstrou ser multirresistente. Palavras-chave: S. aureus; Variantes de colônias pequenas; Dependente de timidina; SCVs

Abstract: In patients with cystic fibrosis (CF) the production of viscous respiratory secretion occurs, which increases the probability of bacterial infections. Staphylococcus aureus is the first pathogen able to colonize and promote infections in the airways in these patients. Variants of small colonies (SCVs) have arisen in S. aureus related to chronic and recurrent infections. SCVs are a large challenge for the laboratory, mainly because they are auxotrophic mutants, which require specific substrates for their growth. The objectives of this study were to evaluate the diagnostic techniques for detection of S. aureus small colony variants (SCVs) in pulmonary infections of patients with cystic fibrosis attended at HC-UFPR ambulatory, as well as to determine the prevalence and the best method for detection of susceptibility to antimicrobial agents. Respiratory samples from 246 patients with CF were collected and inoculated in Mannitol Agar from 2014 to 2016. Small colonies suspected of SCV were identified using 7,5% NaCl agar, catalase and coagulase tests, Vitek®2 Compact identification panel, MALDI-TOF (Vitek® MS - bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) and PCR for the nuc gene. Nutritional dependence was determined to hemin, menadione or thymidine in Mueller Hinton Agar (MHA) by two methods: 1) MHA supplemented with these substrates before inoculation; and 2) addition of disks containing these substrates on the surface of the MHA previously inoculated. The antimicrobial susceptibility test was performed by disk diffusion technique and broth microdilution technique, both supplemented with thymidine. Determinants of resistance to beta-lactams and macrolides were investigated by PCR. Of the 246 patients S. aureus was isolated in 182 (74%) patients. SCVs were isolated in 11 patients (4,5%) and all were thymidine-dependent. The antibiogram showed that 91% of the isolates were resistant to multiple drugs, 9% were resistant to oxacillin (MRSA) and rifampicin, and all were susceptible to vancomycin and linezolid. The mecA (1), ermA (1), ermB (1), ermC (2) and msrB (11) genes were found among the isolates. This research indicates an alert for the microbiologists about the difficulty in the recognizing and identifying of SCVs of S. aureus in the laboratory routine. In addition, it is concern with treatment, since the majority of the isolates proved to be multiresistant. Keywords: S. aureus; small colony variants; Thymidine dependent; SCVs