Determinação de toxinas urêmicas em amostras biológicas por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)

Abstract

Resumo: O interesse crescente nos mecanismos moleculares da toxicidade urêmica tem incentivado os pesquisadores da área de nefrologia a analisar os efeitos patológicos de cada toxina individualmente. Para isso, o monitoramento de suas concentrações em diversos amostras biológicas (como soro, plasma, urina ou em células e tecidos) torna-se importante para permitir uma avaliação detalhada e mecanística de seus efeitos. Além disso, em termos clínicos, a determinação das concentrações das toxinas urêmicas em fluidos biológicos poderá ser utilizada para avaliar o efeito de intervenções dietéticas ou farmacológicas na função renal. Dados da National Kidney Foundation indicam que nos Estados Unidos, Europa e Japão, o número de pacientes com doença renal crônica (DRC) tem aumentado nos últimos anos. A Sociedade Brasileira de Nefrologia (SBN) divulgou no ano de 2011 que o número de doentes renais no Brasil dobrou na última década. Estima-se que no país 10 milhões de pessoas apresentam alguma disfunção renal, e destas, de 90 a 100 mil passam por diálise (SBN, 2011). A síndrome urêmica é causada pela retenção de metabólitos no organismo devido a uma disfunção renal, quando os mesmos deveriam ser eliminados através da urina e/ou metabolizados pelos rins. Em pacientes doentes renais crônicos é muito comum uma excreção urinária deficiente levando ao acúmulo de toxinas urêmicas no plasma, quadro denominado de uremia. A uremia induz disfunção endotelial, inflamação e calcificação vascular, além de estresse oxidativo sistêmico que tende a aumentar com a progressão da doença. Utilizando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) com detecção por fluorescência, estabelecemos um método para identificar e quantificar simultaneamente as concentrações totais de três toxinas urêmicas persistentes (que se ligam a proteínas) em amostras de soro e plasma. Escolhemos as toxinas indoxil sulfato (IS), p-cresilsulfato (PCS) e ácido indol-3 acético (3-IAA) por serem de grande interesse clínico. O método possui alta resolução, com separações rápidas e reprodutíveis. A validação do método foi realizada com base na Resolução 27/2012 (ANVISA) e em outros estudos já publicados. As curvas de calibração para cada toxina apresentaram excelentes linearidades (R2> 0,99) e os limites de quantificação encontrados no soro para IS, p-CS e 3-IAA foram 1,1, 24,5 e 0,2 pmol, respectivamente, e no plasma para IS, PCS e 3-IAA foram 4,8, 8,1 e 0,3 pmol, respectivamente. As precisões intraday e interday apresentaram variações inferiores a 5% para as 3 toxinas nas 2 matrizes estudadas. Além disso estabelecemos um método para analisar a incorporação de indoxil sulfato em células mesangiais em cultura. A identificação e a quantificação das toxinas urêmicas nessas amostras podem contribuir para o acompanhamento da progressão da DRC, bem como alterações na conduta terapêutica. Palavras chaves: toxinas urêmicas, DRC, HPLC, fluorescência.

Abstract: The growing interest in the molecular mechanisms of uremic toxicity has encouraged researchers from the nephrology area to examine the pathological effects of each toxin individually. To this end, monitoring their concentrations in various biological samples (such as serum, plasma, urine and tissues or cell) becomes important to allow a detailed mechanistic evaluation of their effects. Furthermore, in clinical terms, the determination of concentrations of uremic toxins in biological fluids can be used to assess the effects of dietary or pharmacological interventions in renal function. Data from the National Kidney Foundation indicate that in the United States, Europe and Japan, the number of patients with chronic kidney disease (CKD) has increased in recent years. The Brazilian Society of Nephrology (SBN) announced in 2011 that the number of kidney disease patients in Brazil has doubled in the last decade. It is estimated that in our country 10 million people have some renal dysfunction, and of these, 90 to 100 thousand undergo dialysis (SBN, 2011). The uremic syndrome is caused by the retention of metabolites in the body due to renal dysfunction, when they should had been eliminated through the urine and / or metabolized by the kidneys. A poor urinary excretion leading to the accumulation of uremic toxins in the plasma is a feature of chronic renal failure patients. This buildup, referred to as uremia, induces endothelial dysfunction, vascular inflammation and calcification, and systemic oxidative stress, which tends to increase with disease progression. Using high-performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection, we established a method to identify and quantify simultaneously the total concentrations of three persistent uremic toxins (which bind to proteins) in serum and plasma samples. We have chose indoxyl sulfate toxins (IS), p-cresylsulphate (PCS) and 3-indole acetic acid (3-IAA), due to their clinical importance. The method has high resolution, and fast and reproducible separations. The method validation was based on the ANVISA document RDC 27/2012 and other published studies.The calibration curves for each toxin presented excellent linearities, with R2 > 0.99 and the quantitation limits found in serum IS, p-CS and 3-IAA were 1,1, 24,5 and 0,2 pmol, respectively, and in plasma for IS, PCS and 3-IAA were 4.8, 8.1 and 0.3 pmol, respectively. The intraday and interday accuracies showed lower variations of 5% for the 3 toxins in 2 matrices studied. Furthermore, we established a method to analyze the uptake of indoxyl sulphate by mesangial cells in culture. The identification and quantification of uremic toxins in these samples can contribute to the monitoring of CKD progression, as well as to conduct changes in therapeutic approaches. Keys words: uremic toxins, CKD, HPLC, fluorescence.