Alterações nos níveis das lesões oxidativas da Guanina pelo oxigênio singlete geradas na presença de glutationa

Abstract

Resumo: A oxidação do nucleosídeo livre 2'-desoxiguanosina (dGuo) e da base guanina (Gua) por oxigênio molecular singlete (1O2) tem sido estudada ao longo das três últimas décadas, devido ao papel importante de produtos de oxidação do DNA e dos níveis de glutationa em processos como envelhecimento, mutação e carcinogênese. No presente trabalho investigamos a oxidação da dGuo e da Gua por 1O2 na presença do mais importante antioxidante de baixa massa molecular, a glutationa, nas suas forma reduzida (GSH) e oxidada (GSSG). Foram aplicadas diferentes condições de concentração, pH, tempo de incubação, além do uso de um endoperóxido derivado do naftaleno marcado com 18O como fonte de 1O2 marcado (DHPN18O2). Os dados foram obtidos pela da análise dos principais produtos de oxidação da dGuo e da Gua por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e de HPLC acoplado a micrOTOF Q-II: os diastereoisômeros de espiroiminodihidantoina (dSp) e a 8-oxo-2'-desoxiguanosina (8-oxodGuo). Como resultados interessantes, o aumento de 8-oxodGuo gerada a partir de dGuo oxidada por 1O2 na presença de GSH ou GSSG foi confirmado, assim como a diminuição dos níveis de dSp em ambas as condições. A incubação de 8-oxodGuo com DHPNO2 e GSH ou GSSG, ao invés de dGuo, mostrou que a glutationa protege a oxidação de 8-oxodGuo à dSp. Em DNA, o aumento da geração de 8-oxodGuo só foi observado após adição da menor concentração de GSH ou GSSG. Todos os dados de dGuo, 8-oxodGuo e dSp, juntamente com a quantificação o conteúdo residual de GSH/GSSG em cada amostra sugerem fortemente que a glutationa modifica o mecanismo de oxidação da dGuo por 1O2 por desfavorecer a via de formação de dSp. O aumento dos níveis 8- oxodGuo e a diminuição dos níveis de dSp promovidos pela adição de GSH pode ter conseqüências biológicas sérias, tais como o aumento da possibilidade da inserção da 8-oxodGuo pela DNA polimerase, o que pode gerar possíveis mutações e assim aumentar o risco de carcinogênese. Além disso, este trabalho também investigou diversas reações de síntese de 8-oxodGuo por reação contendo Fe2+ ou Cu2+ e H2O2/ascorbato para encontrar aquela de maior rendimento. As reações encontradas na literatura foram analisadas, testadas e modificadas. A 8-oxodGuo sintetizada foi caracterizada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e por HPLC acoplado a micrOTOF. A reação otimizada foi capaz de sintetizar 8-oxodGuo com um rendimento de 72,0%, um resultado muito melhor que o encontrado nas reações propostas por outros autores. Este método otimizado de síntese de 8- oxodGuo é de grande importância para ensaios que possam requerer a síntese de padrões internos marcados com diferentes isótopos.

Abstract: The oxidation of the free nucleoside 2'-deoxyguanosine (dGuo) and of the guanine moiety (Gua) by singlet molecular oxygen (1O2) has been studied over the three last decades due to the major role of DNA oxidation products in process such as ageing, mutation and carcinogenesis. In the present work we investigated the oxidation of dGuo and Gua by 1O2 in the presence of the important low molecular antioxidant, glutathione, in its reduced (GSH) and oxidized (GSSG) forms. There were applied different conditions of concentration, pH, time of incubation, and the use of a [18O]- labeled endoperoxide naphthalene derivative as a source of [18O]-labeled 1O2. Data were obtained through analysis of the main products of oxidation of dGuo and Gua by high performance liquid chromatography (HPLC) and HPLC coupled to micrOTOF Q-II: the diastereomers of spiroiminodihydantoin-2?-deoxyribonucleosides (dSp) and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo). As interesting results, it was observed that the increase in the 8-oxodGuo generated from the dGuo oxidized by 1O2 in the presence of GSH or GSSG was confirmed, as much as the decrease in the dSp levels in the same conditions. The incubation of 8-oxodGuo with DHPNO2 and GSH or GSSG, rather than dGuo, showed that glutathione protects the oxidation of 8- oxodGuo to dSp. In DNA, the increase in the generation of 8-oxodGuo was observed only after adding the lower concentration of GSH or GSSG. All data from dGuo, 8- oxodGuo and dSp quantification together with the analysis of residual GSH/GSSG content in each sample strongly suggest that glutathione modifies the mechanism of dGuo oxidation by 1O2 by disfavoring the pathway of dSp formation. The increased 8- oxodGuo and decreased dSp levels promoted by the addition of GSH can have serious biological consequences, such as increase the possibility of including 8- oxodGuo by the DNA polymerase, which can lead to possible mutations and thus increase the risk of carcinogenesis. Also, the present work investigated different reactions of 8-oxodGuo synthesis using the reactants Fe2+ or Cu2+ and H2O2/ascorbate in order to find the one with best yield. Reactions found in the literature were analyzed, tested and modified. The synthesized 8-oxodGuo was characterized by high performance liquid chromatography (HPLC) and HPLC coupled to micrOTOF. The optimized reaction was able to synthesize 8-oxodGuo with a 72.0% yield, a result much better than those yields found in others reactions proposed by other authors. This improved method for 8-oxodGuo synthesis is of great importance when employing assays that may require the synthesis of internal standards labeled with stable isotopes.