Diagnóstico de câncer colorretal hereditário sem polipose por sequenciamento de nova geração

Abstract

Resumo : Câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC), também conhecido como síndrome de Lynch, é a causa mais comum de câncer colorretal hereditário, correspondente a 2-7% do total de casos de câncer colorretal. Câncer colorretal (abreviado como CRC) é o terceiro tipo mais comum de câncer no mundo. Ele afeta tanto o cólon quanto o reto no intestino grosso. O HNPCC possui um padrão de herança autossômica dominante, com idade de início precoce (41-60 anos). Esta doença pode ser detectada através de técnicas moleculares, com a análise de instabilidade de microssatélites (MSI), pois 90% dos casos de câncer colorretal ocorrendo na síndrome de Lynch apresentam instabilidade de microssatélites. Atualmente um painel de marcadores monomórficos é usado para detectar mutações germinativas em genes do sistema reparo, usando uma técnica baseada em PCR. Este método não é aplicado rotineiramente em todos os tumores devido ao alto custo e necessidade de pessoal especializado. Há também preocupações sobre sua eficiência ao analisar tumores instáveis. Análises amplas do genoma têm demonstrado o impacto da instabilidade de microssatélites, e mostraram que repetições muito menores podem ser usadas para detectar MSI usando sequenciamento de nova geração. O desenvolvimento de um teste baseado em sequenciamento é atraente devido ao seu custo benefício, podendo se analisar uma maior quantidade de amostras de uma só vez. Isso permitiria que o teste de instabilidade de microssatélites pudesse ser aplicado na rotina de hospitais como uma ferramenta de detecção da síndrome de Lynch. O objetivo deste projeto foi desenvolver um novo teste de instabilidade baseado em sequenciamento. Isso foi feito através da análise de 58 amostras tumorais de status MSI conhecido, utilizando 25 marcadores moleculares curtos (7-9pb), permitindo que a instabilidade de cada marcador fosse medida. Com isso pretende-se criar um painel de marcadores robustos para a inclusão em um teste de alta capacidade baseado em sequenciamento. Cinquenta e oito amostras tumorais foram analisadas preliminarmente, utilizando amplicons de 300 pb (tamanho otimizado para o protocolo MiSeq de sequenciamento). Casos que não puderam ser amplificados com este tamanho foram substituídos por casos de status de instabilidade semelhantes. Então os casos selecionados foram amplificados usando o painel de 25 marcadores. Dentre os 25 marcadores apenas quatro apresentaram resultados abaixo do esperado. Como a maioria dos casos foi amplificada com sucesso pelo painel, as amostras foram submetidas ao protocolo MiSeq de sequenciamento. Os resultados de sequenciamento mostraram que 17 dos 25 marcadores apresentaram instabilidade para pelo menos 10% dos casos (em marcadores de 9 pb) e 5% dos casos (em marcadores de 7 e 8 pb). O painel com 17 marcadores apresentou 100% de sensibilidade e 87% de especificidade. Para aumentar a especificidade para 100% decidiu-se por diminuir o número de marcadores para oito. Assim tanto especificidade quanto sensibilidade atingiram 100%. Os resultados se mostraram extremamente positivos, e agora o painel de oito marcadores passará por validação com novas amostras tumorais. Este novo teste permitirá que a análise de instabilidade de microssatélites seja realizada na rotina de hospitais, ajudando a detectar pacientes com síndrome de Lynch, assim como detectando pacientes predispostos a doença, direcionando-os para o tratamento preventivo.