Caracterização de polissacarídeos e metabólicos secundários da casca de endopleura uchi(Huber) cuatrec : avaliação dos efeitos do decocto e de frações polissacarídicas em células hela e macrófagos

Abstract

Resumo: A espécie Endopleura uchi é nativa da região Amazônica e é utilizada na medicina popular na forma de decocto como antiinflamatório, contra infecções urinárias e miomas. Neste trabalho, o decocto e os polissacarídeos obtidos por precipitação etanólica foram avaliados quanto a seus efeitos sobre células HeLa e macrófagos peritoneais. Do decotcto da casca do caule (UX), foi isolado um polissacarídeo bruto (AGb), a partir do qual, após processos de purificação, foi isolado uma arabinogalactana do tipo II (AG), cuja estrutura foi confirmada por análises químicas e espectroscópicas. Este polissacarídeo apresentou uma relação molar de Ara:Gal:Rha:GalA é de 2,6:3,2:0,9:1 e massa molar de 1,09 x 105 g/mol. As frações UX, AGb e AG foram utilizadas nos ensaios biológicos in vitro sobre as células HeLa e macrófagos peritoneais. UX diminui a viabilidade e proliferação celular de forma dose-dependente, atingindo reduções maiores que 50% na dose de 500 ?g/ml. AGb e AG também tiveram este efeito, mas não de forma dose dependente e em torno de 20% de redução nas doses entre 25 e 500 ?g/ml. UX na dose de 250 ?g/ml promoveu aumento na população de células na fase sub-G1 de células marcadas com FITC-anexina e condensação da cromatina verificado por microscopia óptica. Além disso, UX aumentou a liberação de citocromo c. Estes dados sugerem que UX é capaz de promover a morte de células HeLa por apotose através da via mitocondrial. AGb e AG não promoveram morte ceular por apoptose. UX, AGb e AG não estimularam a liberação de óxido nítrico por macrófagos peritoneais nas doses de 25, 50 e 100 ?g/ml. Entretanto, os tratamentos estimularam a liberação de ânions superóxido na presença e ausência de PMA. UX estimulou esta liberação de forma dose dependente, atingindo um aumento de 100% na dose de 100 ?g/ml. Já AGb e AG também estimularam esta via, atingindo um estimulo de 30% na dose de 100 ?g/ml. Macrófagos peritoneais quando tratados com UX, AGb e AG promoveram a ativação destas células evidenciado pela vacuolização do citoplasma e aumento das projeções citoplasmáticas A investigação dos metabólitos secundários de E. uchi mostrou a extração de diversos compostos. Entre eles, a fração extraída com diclorometano a partir das cascas moídas apresentou grande citotoxicidade a células CCRF-CEM. Já o sobrenadante etanólico da precipitação do decocto de E. uchi também apresentou-se citotóxico a células CCRF-CEM. Esta amostra, quando fracionada por silica gel, forneceu uma fração que fortemente diminiu significativamente a viabilidade de células HeLa, indicando que nesta fração se encontra o composto ativo do decocto de E. uchi.

Abstract: Endopleura uchi is a plant from the Amazon region and it it used in traditional medicine, as a decocotion, as an antiinflamatory and against urinary infections and myomas. At this work, the docoction and the polysaccharides isolated from tea were evaluated for their effects at HeLa cells and peritonial macrophages. From barks decoction (UX), it was isolated a crude polyssacharide (AGb), from which, through purification process, a type II arabinogalactan (AG) was isolated. The arabinogalactan strucure was confimed by chemical and spectrometric analysis. This polysaccharide had a molar relation of Ara:Gal:Rha:GalA from 2,6:3,2:0,9:1 and a molar mass of 1,09 x 105 g/mol. The fractions UX, AGb and AG were used for in vitro biological assays against HeLa cells and peritonial macrphages. UX lowered HeLa cell viability and proliferation in a dose dependent manner, reaching inhibitions higher than 50% at 500 ?g/ml. AGb and AG also had the same effect, athough not in a dependent manner and the effect was approximatelly of 20% at doses varying from 25 to 500 ?g/ml. UX at 250 ?g/ml increased HeLa cell population percentage at sub-G1 cell cycle phase, FITC-anexin cells and chromatin condensation verified by optical microscopy. Besides that, UX increased cytochrome c release. Taken together, theses datas suggest that UX may induce apoptosis of Hela cells through the mithocondrial pathway. AGb and AG did not promoted cell death through apoptosis. UX, AGb and AG did not stimulated nitric oxide release by peritonial macrophages at concentrations of 25, 50 and 100 ?g/ml. On the other hand, the treatments stimulated superoxide anions release at presence and absence of PMA. UX stimulated this release in a dose dependent manner, reaching an increase of 100% at 100 ?g/ml. AGb and AG also stimulated this pathway, reaching an increase at this stimulus of 30% at 100 ?g/ml. Peritonial macrophage when treated wih UX, AGb and AG, promoted the activation of these cells as seen by cytoplasm vacuolization and increased cytoplasm projections. These datas sugggest that these treatments might act as biological response modifiers. E. uchi secondary metabolits investigation revealed the a great extraction of compounds. The fraction obtained by dichloromethane had cytotoxicity against CCRF-CEM cells. The ethanolic supernatant of the decoction precipitation of E. uchi barks also was cytotoxic against CCRF-CEM cells. This sample, when fractionated by silica gel, furnished a fraction that greatly inhibited the viability of HeLa cells, indicating that at this fraction the active compound of E. uchi decoction is found.