Efeito da aplicação do campo elétrico na formação de filmes protéicos de GlnB-Hs sobre substratos sólidos

Abstract

Resumo: O efeito do campo elétrico externo sobre a formação de filmes de proteína GlnB-Hs e sobre os componentes da solução tampão foi analisado por curvas de corrente em função do campo elétrico e por microscopia de força atômica (MFA). A proteína GlnB de Herbaspirillum seropedicae (GlnB-Hs) é globular, homotrímerica (36 kDa) e com estrutura tridimensional já determinada por difração de Raios-X. Concentrações de 10 nM e 100 nM de GlnB-Hs nativa e 10 nM de proteína desnaturada foram depositadas sobre lamínula siliconizada e mica sob temperatura e umidade ambientes. Imediatamente após a deposição, campos elétricos máximos de 30 kV/m e 75 kV/m foram aplicados, com taxas de variação de 3 e 30 V/s. As correntes medidas são correntes de superfície e foram analisadas como sendo de corrente de transporte. Para todos os sistemas analisados é necessário um campo elétrico mínimo (valor crítico) para a corrente ser significativa. Dependendo do substrato e dos componentes da solução este campo pode variar de 10 kV/m a 37 kV/m. As imagens de MFA mostraram filmes com alto grau de organização direcional. Tanto nas curvas de I-E quanto nas imagens de MFA, o componente Tris-HCl do tampão tem papel determinante no comportamento das curvas de corrente elétrica e na interpretação das imagens de MFA. Sobre a lamínula siliconizada somente as soluções contendo proteína mostraram evidências de orientação com o campo elétrico aplicado. Enquanto que, sobre a superfície da mica a formação de filmes com orientação preferencial devido ao E foram obtidos na presença e ausência de GlnB-Hs. O transporte da proteína GlnB-Hs sobre a mica observado pelas imagens de MFA foi comprovado por imunodetecção. Estes resultados mostram que o campo elétrico aplicado favoreceu a organização direcional dos filmes de proteína GlnB-Hs e podem contribuir para o entendimento da formação de filmes protéicos sob campo elétricos aplicados. Palavras chave: campo elétrico, filme de proteína GlnB-Hs, mica, lamínula siliconizada, corrente em função do campo elétrico, microscopia de força atômica.

Abstract: The effect of an external electric field on the formation of protein GlnB-Hs films and on its buffer solution on solid surfaces has been analyzed by current vs electric field curves and atomic force microscopy (AFM). The Herbaspirillum seropedicae GlnB protein (GlnB-Hs) is a globular, soluble homotrimer (36 kDa) and the three-dimensional structure was already determined by X-Rays diffraction. Concentrations of 10 nM and 100 nM native GlnB-Hs and 10 nM denatured protein were deposited on siliconized glass slides and on mica at ambient conditions. Immediately after solutions deposition a maximum electric field of 30 kV/m and 75 kV/m where applied with rates of 3 and 30 V/s. The measured currents were current surfaces and were analyzed as transport current. Electric current started to flow only after a minimum electric field (critical value) for all systems analyzed. Depending on the substrate and components of the solution the threshold electric field varies from 10 kV /m to 37 kV/m.The AFM images showed films with high degree of directional organization. The Tris-HCl buffer compound has a decisive role both in the electric current curves pattern as in the AFM images interpretation. On siliconized glass slides evidence of film orientation with the applied electric field was only observed in the AFM images when native and denatured protein were present in the solution. On mica surface films with preferred orientation with applied E were obtained in the presence and absence of GlnB-Hs. The protein GlnB-Hs transport on mica observed by AFM images was confirmed by imunoblotting. These results showed that the applied electric field favored directional organization of the protein GlnB-Hs films and may contribute to understand the formation of protein films under applied electric fields. Keywords: electric field, GlnB-Hs protein film, mica, siliconized glass slide, current vs electric field, atomic force microscopy.