Avaliação da expressão de OAT-1 e OAT-3 e produção de MCP-1 por células endoteliais humanas na presença de toxinas urêmicas (p-Cresol e p-Cresilsulfato)

Abstract

Resumo: A Doença Renal Crônica (DRC) atinge todas as faixas etárias e atualmente é considerada um problema de saúde pública, devido ao constante aumento de sua incidência. O acúmulo de substâncias orgânicas, devido ao comprometimento da excreção renal, ocasiona diversos efeitos deletérios como a inflamação, a progressão da aterosclerose e consequente doença cardiovascular, principal causa de morte nesses pacientes. O p-cresol (PC) e seu conjugado p-cresilsulfato (PCS) são toxinas urêmicas que se ligam a proteínas plasmáticas e por isso não são facilmente dialisadas. A presença de tais toxinas pode desencadear a produção de várias moléculas pró-inflamatórias, como a quimiocina monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), primordial nos eventos que precedem a aterosclerose. OAT 1 e OAT 3 (do inglês, organic anion transporter) são transportadores reconhecidamente importantes na excreção renal de xenobióticos através da secreção tubular. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi a investigação in vitro da influência do PC e PCS na produção de MCP-1 e na expressão destes transportadores em células endoteliais humanas. Como modelo experimental foram utilizadas células da linhagem EA.hy926, cultivadas em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino (SFB) e antimicrobianos. As células foram submetidas a ensaios com as toxinas nas concentrações normal, urêmica e urêmica máxima, sugeridas pelo European Uremic Toxins Work Group (EUTox). As dosagens de MCP-1 foram realizadas através do ensaio de ELISA direto em sobrenadantes de cultura coletados 0, 3 e 6 horas após os tratamentos. A expressão de OAT 1 OAT 3 foi avaliada através da técnica de Dot Blot, realizada com extratos proteicos de células tratadas com PC e PCS. Estes ensaios foram realizados na presença e ausência do inibidor de transportadores de ânions orgânicos, o Probenecida (Pb). Os resultados obtidos demonstram que a produção de MCP-1 respondeu aos tratamentos de forma dose e tempo dependente, obtendo picos de produção no tempo 6h, na concentração máxima urêmica do PC (646 pg/mL) e na concentração urêmica do PCS (435 pg/mL). No tempo 0h, o Pb suprimiu a produção de MCP-1 consideravelmente em todos os tratamentos, com taxas de inibição de 71%, 66% e 71% nos tratamentos com PC e 58%, 56% e 60% nos tratamentos com PCS na concentração normal, urêmica e urêmica máxima, respectivamente. No tempo 6h foi observada uma taxa de inibição de 37% e 32% nos tratamentos com PC e 36% e 46% nos tratamentos com PCS na concentração urêmica e urêmica máxima, respectivamente. A expressão de OAT 1 nos tratamentos controle, PC e PCS nas concentrações máximas urêmicas foi suprimida por Pb com taxa de inibição de 30%, 23% e 12%, respectivamente. A expressão de OAT 3 nos tratamentos controle, PC e PCS foi suprimida por Pb com taxa de inibição de 45%, 2% e 32%, respectivamente. Como conclusão, os dados obtidos no presente trabalho sugerem que, em células endoteliais humanas, o OAT1 se expressa duas vezes mais que OAT 3. E que, considerando-se a resposta celular relacionada à produção de MCP-1, o OAT 1 tem preferência pelo PC como substrato, enquanto o OAT 3 tem mais afinidade pelo PCS. Palavras chave: doença renal crônica; toxicidade urêmica; p-cresol; p-cresilsulfato; OAT 1; OAT 3; Probenecida; MCP-1.

Abstract: Chronic Kidney Disease (CKD) affects all age and is currently considered a public health problem, due to the constant increase in incidence. The accumulation of organic substances due to the impairment of renal excretion causes many deleterious effects such as inflammation, progression of atherosclerosis and subsequent cardiovascular disease, the mainly cause of death in CKD patients. p-cresol (PC) and its conjugate pcresilsulfato (PCS) are uremic toxins difficult to eliminate by conventional dialysis due to strong bind to plasma proteins. The high presence of such toxins can trigger the production of various proinflammatory molecules such as chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), which is overriding in the events preceding atherosclerosis. OAT1 and OAT3 (organic anion transporter) are known to be important carriers in the renal excretion of xenobiotics by tubular secretion. Thus, the objective of this study was the in vitro investigation of the PC and PCS influence on the production of MCP-1 and expression of these transporters and on human endothelial cells. As an experimental model, we used the human endothelial cell line EA.hy926 cultured in DMEM supplemented with fetal bovine serum (FBS) and antibiotics. The cells were subjected to tests with the toxins in normal, uremic and maximum uremic concentrations, suggested by the European Uremic Toxins Work Group (EuTox). The levels of MCP-1 were evaluated in culture supernatants collected 0, 3 and 6 hours after treatment through ELISA. The expression of OAT 1 and OAT 3 was evaluated through Dot Blot, performed with protein extracts from cells treated with PC and PCS. These assays were performed in the presence and absence of the organic anion transporters inhibitor Probenecid (Pb). The results shown that the secretion of MCP-1 responded to the treatment in a dose and time dependent pattern, resulting in production peaks at 6h in PC maximum uremic concentration (646 pg/ml) and PCS uremic concentration (435 pg / ml). At 0h, Pb suppressed the production of MCP-1 significantly in all treatments, with inhibition rates of 71%, 66% and 71% in treatments with PC and 58%, 56% and 60% in treatments with PCS on the normal, uremic and maximum uremic concentrations, respectively. At 6h, an inhibition rate of 37% and 32% was observed in treatments with PC and 36% and 46% in treatments with PCS in uremic and maximum uremic concentration, respectively. The expression of the OAT 1 in the control, PC and PCS treatments under uremic maximum concentration was suppressed by Pb with a inhibition rate of 30%, 23% and 12%, respectively. The expression of the OAT 3 in the control, PC and PCS treatments under uremic maximum concentration was suppressed by Pb with a inhibition rate of 45%, 2% and 32%, respectively. As a conclusion, the data of the present study suggest that, in human endothelial cells, OAT1 is expressed two times more than OAT 3. And, considering the cell response related to the production of MCP-1, PC is the substrate for OAT 1 and OAT 3 has more affinity for PCS. Key-words: chronic kidney disease; uremic toxicity; p-cresol; p-cresilsulfate; OAT 1; OAT 3; Probenecid; MCP-1.