Produção de oligossacarídeos prebióticos a partir de diferentes pré-tratamentos de fitobiomassas

Abstract

Resumo: Oligossacarídeos (OS) prebióticos, que auxiliam na promoção da saúde intestinal, foram produzidos a partir de fitobiomassa, tanto quando se utilizou a técnica de préprocessamento de ligno(hemi)celulósicos, bagaço de cana e serragem de Pinus taeda, por termopressurização com ácido fosfórico diluído, quanto por hidrólise de galactomananas, utilizando enzimas do suco digestivo do molusco Achatina fulica ou de enzimas extra e/ou intracelulares de Aspergillus niger, induzidas pela presença de polissacarídeos. A hidrólise por termopressurização ocorreu com variação do pH de ácido O-fosfórico de 1,75 até 2,5, utilizando água como controle, e também das pressões de 3 atm (144 °C) até 12 atm (192 °C). Quanto à produção de OS, o bagaço propiciou os melhores rendimentos (mg/g) com maior porcentagem de pureza nas condições entre 7 e 8 atm e pH entre 2,2 e 2,5. Já com o Pinus, foram requeridas condições ligeiramente mais brandas, entre 5 e 7 atm e pH entre 2,3 e 2,5. Visando otimizar o processo de produção de OS, uma alteração metodológica foi avaliada, com a proporção biomassa:ácido passando de 1:6 para 1:8 (m/v) e a filtração simples por lã de vidro alterada para funil de placa porosa associada a vácuo. Nestes ensaios o pH variou entre 1,5 e 2,5 e a pressão entre 7 atm (171 °C) e 10 atm (185 °C). Considerando as melhores respostas obtidas, a produção de OS passou de 59,21 para 100,26 mg/g para o bagaço e de 65,68 para 107,26 mg/g para Pinus. Entretanto houve uma redução na pureza dos hidrolisados, de cerca de 90% para 71,87% para o bagaço e 80,40% para Pinus. Analisado os dados através de planejamento fatorial, o pH é a variável mais significativa (do que a pressão/temperatura) para variação das respostas de produção e pureza e que para ambas as biomassas avaliadas a condição ótima foi de pH 2,5 e 2,25 a 7 atm. Os OS produzidos foram utilizados como fonte de carbono em cultivos de Lactobacillus casei Shirota e de Bifidobacterium animalis havendo biossíntese de ácidos graxos de cadeia curta (ácido lático e/ou acético) atingindo ápice após 72 h de cultivo com pH final de 4,7 para OS de bagaço e 4,5 para OS de Pinus. Considerando a sacarificação enzimática da celulose residual proveniente do pré-tratamento fosfórico com celulases industriais, comparativamente aos controles nativos, todas as condições avaliadas revelaram-se benéficas e nos melhores casos, em cinco vezes para o bagaço e três vezes para o caso de Pinus. A obtenção de enzimas a partir de indução com galactomananas e pectina cítrica, realizada por cultivo em meio líquido e agitação, ocorreu de maneira satisfatória com a formação de pellets de Aspergillus niger. Foram obtidas <130 ?g e <250 ?g de proteínas totais/mL para as amostras extra e intracelulares, respectivamente. A coleta do suco digestivo do Achatina fulica (SDAf) foi realizada a partir de moluscos considerados jovens e adultos (conchas >3 cm) e mostrou alta concentração proteica, na ordem de 202 mg/mL. Testes de atividade enzimática com P-nitrofenilglucosídeos indicaram alta atividade de ?-galactosidase e ?-glucosidase para as amostras de A. niger e ?-manosidase e ?-glucosidase para o SDAf. A porcentagem de hidrólise com polissacarídeos diversos em 24 h, 35 °C e 140 rpm (0,33 g), mostrou que as enzimas mais eficientes de A. niger foram as extra e intracelulares induzidas com goma de guar, respectivamente, ensaiadas com os substratos alfarroba (3,65 e 4,87%), guar (5,88 e 4,33%) e bracatinga (3,83 e 3,25%) com liberação de OS. As enzimas induzidas com goma de alfarroba liberaram apenas as unidades de ?-galactose das ramificações. O SDAf mostrou potencial para a hidrólise de todos os polissacarídeos avaliados, mas por conter baixa atividade ?- galactosidase, não conseguiu hidrolisar com eficiência galactomananas mais substituídas como as da bracatinga (apenas 4,36%). Conforme o grau de substituição reduz, ocorre aumento do poder hidrolítico com goma guar (8,54%) e alfarroba (33,66%). Os OS de alfarroba, obtidos por hidrólise dom SDAf, foram capazes de promover o crescimento dos micro-organismos probióticos, com a produção dos ácidos láctico, acético e propiônico com o crescimento de L. casei e destes mesmos ácidos mais o ácido succínico com B. animalis. Palavras-Chave: Hidrólise ácida e enzimática. Ligno(hemi)celulósicos. Achatina fulica. Aspergillus niger. Lactobacilos. Bifidobactérias.

Abstract: Prebiotic oligosaccharides (OS), which assist in the intestinal health promotion, were produced from phytobiomass, both when using sugar cane bagasse or pine sawdust ligno(hemi)celluloses thermo-pressurization pre-processing technique with diluted phosphoric acid, or galactomannans hydrolysis using the digestive juice of Achatina fulica or Aspergillus niger intra- and extra-cellular enzymes induced by polysaccharides. The thermo-pressurization hydrolysis occurred varying the phosphoric acid pH from 1.75 to 2.5, using water as control, and pressures of 3 atm (144 °C) to 12 atm (192 °C). OS production showed best yields (mg/g) with the highest purity percentages when obtained from sugarcane bagasse hydrolysis in conditions between 7 to 8 atm and pH between 2.2 and 2.5. Pinus taeda required slightly milder conditions, between 5 to 7 atm and pH between 2.3 and 2.5. To optimize the production process, a methodological change was adopted with biomass: acid ratio from 1:6 to 1:8 (w/v) and the simple glass wool filtration replacement for a fritted glass funnel with vacuum. For these assays the pH ranged from 1.5 to 2.5 and the pressure of 7 atm (171 °C) and 10 atm (185 °C). OS production best responses increased from 59.21 to 100.26 mg/g for bagasse and from 65.68 to 107.26 mg/g for Pinus. However, there was a purity reduction of the hydrolysates from about 90% to 71.87% in the case of bagasse and 80.40% in case of Pinus. A factorial design analysis showed that the pH is more significant (than the pressure/temperature) for the production and purity changes for both biomass, confirming an optimal condition of pH 2.5 and 2.25 with 7 atm. Used as the sole carbon source, these OS supported the growth of Lactobacillus casei Shirota and Bifidobacterium animalis, togheter a peak biosynthesis of short-chain fatty acids (lactic and/or acetic acids) after 72 h cultivation with a final pH of 4.7 for bagasse and 4.5 for Pinus. Considering the residual cellulose, after the phosphoric pre-treatment, its subsequent enzymatic hydrolysis with industrial cellulases, in comparison with the native controls, all the evaluated conditions revealed beneficial for improved hydrolyses and, in the best cases, by factors of five times for bagasse and three times for Pine. Galactomannans degrading-enzymes induction by cultivation of Aspergillus niger in a liquid medium under agitation was satisfactory, leading to mycelia pellets formation. It was found <130 ?g and <250 ?g total protein/mL for extra- and intracellular samples, respectively. Digestive juice of Achatina fulica (DJAf) collection was carried out in young and adults (>3 cm) molluscs, and corresponded to a high protein concentration, 202 mg/mL. Enzymatic activity assays done with P-nitrophenylglycosides, indicated high ?-galactosidase and ?-glucosidase activities for A. niger samples and the same for ?-mannosidase and ?-glucosidase from DJAf. The hydrolysis percentages with various polysaccharides, pursuing oligosaccharides release in 24 hours, 35 °C and 140 rpm (0.33 g) incubation conditions, showed that the most efficient extra and intracellular A. niger enzymes were induced with guar gum, as assayed using locust bean (3.65 and 4.87%) and guar gums (5.88 and 4.33%) and Mimosa scabrella galactomannans (3.83 and 3.25). Carob induced enzymes released only ?-galactose from the branching points. DJAf showed hydrolysis potential for all polysaccharides tested, but contained low ?-galactosidase activity and could not hydrolyze efficiently (4.36%) the more branched galactomannans, such as that from Mimosa scabrella. As the degree of substitution of galactomannans reduces, the hydrolytic power increases as shown with guar (8.54%) and locust bean gums (33.66%). The locust bean OS, produced by DJAf hydrolysis, were able to promote the growth of probiotic microorganisms, leading to lactic, acetic and propionic acids production with L.casei and the same acids more succinic acid with B. animalis. Keywords: Acid and enzymatic hydrolysis. Ligno(hemi)Cellulose. Achatina fulica. Aspergillus niger. Lactobacilli. Bifidobacteria.