Viabilidade in vitro apos vitrificação de blastocitos de Mus domesticus domesticus cultivados a partir de embriões de 1-celula

Abstract

Resumo: Foram realizados três experimentos para se avaliar o desenvolvimento in vitro de blastocistos de Mus domesticus domesticus (CF1xSWISS) cultivados a partir de embriões de 1-célula, após exposição e vitrificação em solução crioprotetora contendo 9,0M de EG acrescido ou não de 0,3M de SAC. No experimento 1, após o cultivo de 755 embriões de 1-célula, foram observadas taxas de eclosão de 53,0% para o meio HTF e de 61.7% para o meio KSOM (P>0,05), suplementados com 4mg/ml de BSA + 20 e 25mM de HEPES. No experimento 2 testaram-se os possíveis efeitos tóxicos das soluções crio protetoras propostas: VS1 = 1,8M EG em PBS + 6%BSA (60s) seguido de 9,0M EG em PBS + 6%BSA (imersão direta) e VS2 = 9,0M EG + 0,3M SAC em PBS + 6%BSA (imersão direta) em 152 blastocistos cultivados a partir de embriões de 1-célula em meio KSOM com 25mM de HEPES. Não houve diferença significativa (P>0,05) entre os grupos controle (86,0%), VS1 (82,3%) e VS2 (78,4%). No experimento 3, 140 blastocistos cultivados por 72h em meio KSOM com 4mg/ml de BSA e 25mM de HEPES foram vitrificados em palhetas de 0,25ml modificadas (OPSm) nas soluções crioprotetoras acima descritas, alcançando taxas de eclosão de 45,7 e 41,4% para VS1 e VS2 (P>0,05), respectivamente. Portanto, concluiu-se que ambos os meios, HTF e KSOM acrescidos de BSA e HEPES, proporcionaram o completo desenvolvimento embrionário in vitro. Apesar de não ter ocorrido diferença estatística (P>0,05), no meio KSOM observou-se que os embriões tiveram uma curva de crescimento mais homogênea e melhores taxas de eclosão, representando mais uma alternativa para o cultivo de embriões de 1-célula. Igualmente, não houve variação significativa (P>0,05) nas taxas de eclosão para os blastocistos de Mus domesticus domesticus vitrificados nas soluções crioprotetoras contendo 9,0M de EG com ou sem o acréscimo de 0,3M de SAC

Abstract: Three experiments were carried out in order to evaluate the in vitro development of Mus domesticus domesticus (CF1 x SWISS) blastocysts cultured from one-cell embryos after exposition and vitrification in a cryoprotectant solution composed of 9.0M EG additioned or no of 0.3M SAC. In the first experiment, after the culture of 755 one-cell embryos, were observed the hatching rates of 53.0% for HTF medium and 61.7% for KSOM medium (P>0.05) supplemented with 4mg/ml BSA + 20 and 25mM HEPES, respectively. In the second experiment were evaluated the capacity of the embryos to hatching after exposition to the cryoprotectant solutions proposed (VS1 = 1.8M EG in PBS + 6% BSA (120s) followed by 9.0M EG in PBS + 6% BSA and VS2 = 9.0M EG + 0.3M SAC in PBS + 6% BSA). First the embryos were cultured from one-cell to blastocyst stage and after 152 blastocysts were exposed to the vitrification solutions (VS1 and VS2). The exposition don't showed significant difference (P>0.05) among the control (86.0%), VS1 (82.3%) and VS2 (78.4%) groups. In the third experiment 140 blastocysts cultured for 72h in KSOM with 4mg/ml BSA + 25mM HEPES were vitrified in 0.25ml modified straws (OPSm) in the cryoprotectant solutions previously described, reaching hatching rates of 45.7 and 41.4% in VS1 and VS2 (P>0.05), respectively. Then, it was concluded that both, HTF and KSOM + BSA and HEPES produced a complete in vitro preimplantation embryos development.. However, the embryos cultured in KSOM medium showed a homogeneous growing curvature and higher hatching rates, which can be another alternative for culture of one-cell embryos. Equally, there were no differences (P>0.05) in the hatching rates between Mus domesticus domesticus vitrifed blastocysts in cryoprotectant solutions containing 9.0M EG with or without the addition of 0.3M SAC