Caracterização térmica por calorimetria exploratória diferencial (DSC) das frações ricas em glutenina do trigo (Triticum aestivum, cultivar BRS-Parrudo) obtidas por diferentes métodos de extração

Abstract

Resumo: A denominação glúten é dada para o conjunto de proteínas encontradas em diversos cereais, sendo estas responsáveis por conferir à massa a coesão e a retenção de gases durante a fermentação. As principais proteínas que compõem o glúten são a gliadina e a glutenina. Estas são proteínas insolúveis em água, sendo a gliadina solúvel em solução alcoólica e glutenina solúvel em soluções ácidas e alcalinas. Por serem as principais proteínas da farinha de trigo, o estudo do comportamento térmico destas frações proteicas é essencial para o projeto de unidades de processamento desta matéria-prima. Entretanto, o processo de separação e purificação destas proteínas tendem a alterar as propriedades físico-químicas destas frações. Desta forma, este trabalho tem como objetivo avaliar as frações ricas em glutenina obtidas da farinha de trigo (cultivar BRS-Parrudo – Embrapa), separadas por quatro métodos de extração, sendo estes assim denominados: extração padrão, extração com adição de DTT (ditiotreitol), extração por decantação e a extração direta. A quantidade de proteína obtida em cada extração foi quantificada pelo método de Bradford, sendo que as massas molares foram avaliadas por eletroforese em gel desnaturante SDS-PAGE. A temperatura de desnaturação das frações proteicas foi determinada pela calorimetria exploratória diferencial (DSC) e o grau de desnaturação destas frações foi avaliado por dicroísmo circular (CD). Na análise de Bradford, as concentrações de proteínas na extração padrão, extração com adição de DTT e na extração por decantação foram de 0,20 mg/mL, 0,30 mg/mL e 0,16 mg/mL, respectivamente, enquanto que na extração direta foi obtida maior concentração de proteína, 8,87 mg/mL. Na extração direta ocorre uma única etapa de extração, na qual são obtidas diversas frações proteicas, além da fração de interesse. Isto pode explicar o fato da maior concentração de proteína obtida nessa extração. As bandas identificadas na eletroforese para a avaliação das massas molares foram: 86,7 ± 2,9 Kda, para as frações de alta massa molar, e 48,3 ± 0,5 KDa e 39,1 ± 0,45 Kda, para as de baixa massa molar. A análise das frações proteicas por dicroísmo circular, revelou que as mesmas não sofreram desnaturação durante os processos de extração. A análise de DSC para a avaliação das quatro diferentes extrações revelou uma pequena variação da temperatura de desnaturação entre as amostras extraídas. Na extração padrão e extração direta foram obtidas as temperaturas de desnaturação de 64,3 ± 0,62°C e 67,2 ± 0,52°C, respectivamente e os eventos térmicos foram endotérmicos, com variação de entalpia de aproximadamente -3,95 J/g na extração padrão e -10,80 J/g na extração direta. Para a extração com adição de DTT, a temperatura de desnaturação foi de 65,1 ± 1,74°C e a variação de entalpia de -12,68 J/g. Essas amostras passaram pelo processo de diálise no intuito de eliminar interferentes. Foi observado uma pequena variação nas temperaturas de desnaturação, porém os picos obtidos apresentaram uma melhor definição, confirmando a eliminação dos contaminantes. Este trabalho demonstrou que o método de extração empregado pode alterar as propriedades das proteínas do glúten, especificamente a glutenina, sendo a análise de DSC um método robusto, rápido e confiável para avaliação destes extratos. As frações de glutenina extraída da farinha de trigo do cultivar BRS-Parrudo da Embrapa apresentou temperatura de desnaturação intermediária, quando comparada com os valores já encontrados na literatura para outros cultivares. PALAVRAS-CHAVE: Glúten, desnaturação, ditiotreitol (DTT), propriedades físico-químicas

Abstract: Gluten is the name given to the group of proteins found in some cereals, which are responsible for conferring cohesion to the mass and retention of gas during fermentation. The major proteins which comprise the gluten are gliadin and glutenin. These proteins are insoluble in water. Gliadin is soluble in alcoholic solution and glutenin is soluble in acidic and alkaline solutions. Because they are the major proteins of wheat flour, the study of the thermal behavior of these protein fractions is essential for the design of processing units of this raw material. However, the process of separation and purification of these proteins tend to alter the physicochemical properties of these fractions. Thus, this study aims to evaluate the fractions ofglutenin obtained from wheat flour (BRS-stout - Embrapa) and separated by four methods, which are named as: standard extraction, extraction with addition of DTT (dithiothreitol ), extraction by decantation and the direct extraction. The amount of protein obtained at each extraction was quantified by the Bradford method, and the molecular weights were analyzed by gel electrophoresis on denaturing SDS-PAGE. The denaturation temperature of the protein fractions was determined by differential scanning calorimetry (DSC) and the degree of denaturation of these fractions was assessed by circular dichroism (CD). The results showed that the protein concentration in standard extraction, extraction by addition of DTT and decantation were 0.20 mg / ml, 0.30 mg / ml and 0.16 mg / ml, respectively. It was observed that direct extraction obtained a higher protein concentration, 8.87 mg / ml. In the direct extraction which consists in a single extraction step, various protein fractions are obtained with the fraction of interest protein. This may explain the fact that the highest concentration of protein was obtained in this extraction. The bands identified in electrophoresis for assessment of molecular weight were 86.7 ± 2.9 kDa for the high molecular weight fractions, and 48.3 ± 0.5 kDa and 39.1 kDa ± 0.45 for the low molecular weight. The analysis of the protein fractions by circular dichroism revealed that they did not undergo denaturation during the extraction process. The DSC analysis for the evaluation of four different extractions revealed a small variation of the denaturing temperature between the samples. In the standard extraction and direct extraction were obtained the denaturation temperatures of 64,3 ± 0,62°C e 67,2 ± 0,52°C, respectively, thermal events were endothermic and the enthalpy obtained was approximately -3.95 J / g in the standard extraction and -10.80 J / g for the direct extraction. For the extraction with the addition of DTT, the denaturation temperature was 65,1 ± 1,74°C and the enthalpy change of -12.68 J / g. These samples passed through the dialysis process in order to eliminate interfering. A small change in denaturation temperature was observed, but peaks obtained showed a better definition, confirming the removal of contaminants. This study demonstrated that the type of extraction method can change the properties of gluten proteins, specifically the glutenin, and the DSC analysis is a robust, fast and reliable method for assessing these statements. The fractions of glutenin extracted from wheat flour of BRS-stout Embrapa showed intermediate denaturation temperature when compared with the values already found in the literature for other cultivars. KEY-WORDS: Gluten, denaturation, dithiothreitol (DTT), physicochemical properties