Caracterização de proteína TcZC3H31 de Trypanosoma cruzi, uma CCCH ZINC Finger essencial para metaciclogênese

Abstract

Resumo: O protozoário Trypanosoma cruzí, agente causador da Doença de Chagas, possui características incomuns em relação à organização e expressão gênicas, tais como genes arranjados em polícístrons, transcritos processados por uma reação de trans splícíng, ausência promotores clássicos da RNA Polimerase 11 e poucos fatores de transcrição codificados em seu genoma. Essas características sugerem que a regulação diferencial da expressão gênica, que permitem um ciclo de vida complexo, é controlada por mecanismos pós-transcricionais, principalmente através de elementos em eis presentes, em geral, nas regiões não traduzidas (UTRs) dos mRNAs e de proteínas ligadoras de RNA (fatores em trans). As proteínas CCCH zínc fínger, caracterizadas por possuírem três resíduos de cisteína e um de histidina que coordenam um íon zinco na sequência C-X7;8-C-X5-C-X3-H, estão entre as proteínas ligadoras de RNA que promovem o controle do processamento, estabilidade, distribuição e tradução dos mRNAs. O objetivo do presente trabalho foi estudar o papel que proteína TcZC3H31 (a qual possui três domínios CCCH zínc fínger) desempenha durante o ciclo de vida do T. cruzí, usando técnicas como nocaute gênico, superexpressão e ribonômica. Essa proteína é expressa quase que exclusivamente nas formas epimastigota e tripomastigota metacíclico. Durante a divisão celular (G2, mitose e citocinese) de epimastigotas foram observadas estruturas com alta concentração dessa proteína, as quais não são observadas nos parasitas em na fase G1 do ciclo celular. Foram obtidos parasitas nocautes para esse gene, os quais foram incapazes de se diferenciar de epimastigota para a forma tripomastigota metacíclico, enquanto parasitas superexpressando TcZC3H31 se diferenciam com maior eficiência do que os parasitas selvagens, sugerindo que essa proteína é essencial para a diferenciação do T. cruzí. Ensaios de imunoprecipitação de RNA seguida de sequenciamento (experimentos de ribonômica) permitiram a identificação de mRNAs alvos dessa proteína. A maioria dos genes identificados nessa análise codificam proteíno-quinases. O padrão de expressão de alguns RNAs alvos foi avaliado por PCR quantitativa ao longo do ciclo de vida e nos parasitas mutantes obtidos. Através dessas análises foi possível identificar um grupo de 5 genes para os quais padrão de expressão acompanha ao da proteína TcZC3H31, ou seja, seus mRNAs estão aumentados quando a proteína está superexpressa e diminuídos quando a proteína está ausente (nocaute gênico). Palavras-chave: Trypanosoma cruzí. CCCH zínc fíngers. Regulação da expressão gênica. Regulação pós-transcricional. Metaciclogênese.

Abstract: The protozoan parasite Trypanosoma cruzí is the causative agent of chagas disease and presents unusual gene expression and organization features. For example, genes are arranged in polícístrons, transcripts are processed through a trans splícíng reaction, and their genome lacks the classic RNA Polymerase li promoters and encodes only a few transcription factors. Those features suggest that the differential regulation of gene expression, required for the complexity of their life cycle, is controled at the posttranscriptional level, mainly through eis contrai elements, which are generally present in the untranslated regions (UTRs) of mRNAs and trans-acting factors, such as RNAbinding proteins (RBPs). The CCCH zínc fínger proteins are characterized by the presence of three cystein and one histidine residues that coordinate the zinc ion in the motif C-X718-C-X5-C-X3-H. They are RNA binding proteins that contrai mRNA processing, stability, distribution and translation. The aim of the present work was to to examine the role that the TcZC3H31 (a three CCCH zínc fínger motifs-containing protein) plays during the life cycle of T. cruzí. TcZC3H31 is almost exclusively expressed in the epimastigote and metacyclic trypomastigote forms. During cell division (G2, mytose and cytokinesis phases) TcZC3H31 was concentrated in structures, which were not observed in the G1 phase. T. cruzí null mutant for TcZC3H31 gene is not able to undergo differentiation to metacyclic trypomastigote forms, whereas TcZC3H31- superexpressing parasites differentiate more efficiently than wild type counterpart. These data suggest that TcZC3H31 protein is essential for T. cruzí differentiation. RNA immunoprecipitation followed by sequencing (ribonomic assays) identified the TcZC3H31 mRNA targets. Most of them encode for protein kinases. The expression pattern of some targets through the life cycle and in the mutant parasites was measured by quantitative PCR. This analysis enabled the identification of a 5 genes group wich showed an expression pattern similar to the expression of TcZC3H31 protein, with an increase of these mRNAs in response to the protein overexpression and a decrease in the protein absence (gene knockout). Key words: Trypanosoma cruzí. CCCH zínc fíngers. Gene expression regulation. Postranscriptional regulation. Metacyclogenesis.