Abordagem fitoquímica, avaliação farmacológica, antimicrobiana e toxicológica de Rourea induta Planch. (Connaraceae)

Abstract

Resumo: A espécie Rourea induta Planch. (Connaraceae), popularmente conhecida como campeira, chapeudinha ou pau-de-porco, possui poucos estudos registrados na literatura, mas espécies da mesma família apresentam atividades farmacológicas interessantes. O objetivo deste estudo foi avaliar as características fitoquímicas, verificar as atividades antinociceptiva, anti-inflamatória, antiparasitária, antifúngica, antibacteriana e a toxicidade dos extratos e frações provenientes das folhas de Rourea induta. Foram isolados e identificados treze compostos, da fração acetato de etila: epicatequina, guaijaverina, isoquercetrina, ácido 5-O-cafeoilquínico metil éster e procianidina B2; do extrato aquoso: procianidina C1, ácido clorogênico e ácido neoclorogênico; e da fração clorofórmio filtrada em poliamida: (6S,9S)-roseosideo, (6S,9R)-roseosideo, citrosideo A, byzantionosideo B e blumenol C glucosideo. Foi desenvolvido e validado um método em CLAE para quantificação do composto marcador dp extrato, a hiperina, isolada e identificada previamente. A atividade antinociceptiva foi avaliada in vivo pelo teste da formalina, através do qual o extrato aquoso (100 mg/kg; v.o.) apresentou inibição das duas fases do teste, demonstrando atividade antinociceptiva e anti-inflamatória. No teste de hipersensibilidade mecânica (CFA 70%), o extrato aquoso (100 mg/kg; v.o.) apresentou redução da hipersensibilidade e efeito anti-inflamatório pela redução das citocinas TNF-? e IL-1? na pata e medula dos camundongos, o qual foi capaz também de inibir a nocicepção causada pelo TNF-? em injeção intratecal. O sistema opióde não está envolvido no mecanismo de ação antinociceptivo do extrato aquoso. O potencial antioxidante e a capacidade de hepatoproteção foi avaliada com o extrato etanólico (500 mg/kg; v.o. 7 dias) pela capacidade de seqüestro de radicais livres (SRL) e atividade hepatoprotetora em ratos com lesão hepática induzida por tetracloreto de carbono (CCl4). O extrato etanólico apresentou ação protetora contra lesões hepáticas induzido por CCl4 evidenciado pela redução significativa nas atividades de enzimas séricas marcadoras de lesão hepática (ALT e AST). O extrato restaurou ainda o desequilíbrio induzido pelo CCl4, evidenciado pela redução da peroxidação lipídica (SRAT), o aumento do conteúdo de glutationa e do sistema enzimático de defesa antioxidante (SOD, CAT, GPx) para valores próximos aos normais. A ação hepatoprotetora foi confirmada pela análise histológica do fígado. Na avaliação de toxicidade aguda em camundongos os extratos etanólico e aquoso apresentaram sinais brandos de toxicidade renal e hepática nas maiores doses (300 e 2000; mg/kg v.o.) quando administrados em dose única. A atividade anti-inflamatória in vitro, avaliada pela produção de óxido nítrico por células RAW264.7, foi demonstrada pela fração clorofórmio e clorofórmio filtrada em poliamida (100 ?g/mL) (50% de inibição) e por três glicosídeos isolados, (6S,9S)-roseosideo, byzantionosideo e blumenol C glucosideo (30% de inibição) (50 ?g/mL). A produção de TNF-? por essas células foi inibida pelo extrato aquoso filtrado em poliamida, extrato etanólico filtrado em poliamida e fração acetato de etila filtrado em poliamida (100 ?g/mL) com 5h de estimulação LPS. A atividade antimicrobiana foi avaliada pela concentração inibitória mínima. Para atividade leishmanicida e tripanocida todas as amostras testadas foram inativas. No teste antifúngico a fração acetato de etila (CIM = 64 ?g/mL), hexano (CIM = 256 ?g/mL) e clorofórmio (CIM = 256 ?g/mL) apresentaram atividade contra C. albicans, e as duas primeiras foram ativas também contra C. parapsilosis (CIM = 16 e 64 ?g/mL respectivamente). Os extratos brutos aquoso e etanólico apresentaram atividade contra bactérias Gram positivas, S. aureus (CIM = 39 e 78 ?g/mL respectivamente) e E. faecalis (CIM = 78 ?g/mL), e uma baixa atividade contra bactérias Gram negativas E. coli e P. aeruginosa. A fração acetato de etila apresentou atividade contra os dois tipos de bactérias. Nenhuma amostra apresentou citotoxicidade contra células KB e MRC5, nem atividade hemolítica, portanto não são tóxicas nesses métodos. Os resultados encontrados incentivam a continuação da pesquisa com os extratos das folhas de R. induta, pois esses podem ser considerados promissores na busca e desenvolvimento de novos fármacos. Palavras-chave: Rourea induta, anti-inflamatório, hepatoproteção, toxicidade, antimicrobianos.

Abstract: The species Rourea induta Planch., (Connaraceae), popularly known as campeira, chapeudinha or pau-de-porco, has few studies reported in the literature, but many species in this family have interesting pharmacological activities described. The aim of this study was evaluate the phytochemical characteristics, the antinociceptive, anti-inflammatory, antiparasitic, antifungal, antibacterial and toxicity of extracts and fractions from the leaves from Rourea induta. Were isolated and identified thirteen compounds, from the ethyl acetate fraction: epicatechin, guaijaverine, isoquercetrine, 5-O-caffeoylquinic acid methyl ester and procyanidin B2; from aqueous extract: procyanidin C1, chlorogenic acid, and neochlorogenic acid; and from chloroform fraction filtered in polyamide: (6S,9S)-roseoside, (6S,9R)-roseoside, citroside A, byzantionoside B and blumenol C glucoside. An HPLC method for the extract marker compound quantification, the hyperin, isolated and identified previously, was developed and validated.The antinociceptive activity was evaluated in vivo by the formalin injection test, whereby the aqueous extract (100 mg/kg; p.o.) showed inhibition in both phases, showing antinociceptive and antiinflammatory activity. In mechanical allodynia evaluation (70% CFA), the aqueous extract (100 mg/kg; p.o.) showed reduction of allodynia and showed anti-inflammatory effect by reducing cytokines TNF-? and IL-1? in mice paw and spinal cord, which was also able to reduce the nociception caused by TNF-? intrathecal injection. The opioid system is not involved as the antinociceptive mechanism of aqueous extract action. The antioxidant potential and the liver protection potential were evaluated with the ethanol extract (500 mg/kg; p.o. 7 days) in rats with carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver injury. The ethanolic extract showed a protective action against liver injury evidenced by significant decrease of liver injury serum enzymes markers (ALT and AST). The extract also restored the imbalance induced by CCl4 as evidenced by the decrease in lipid peroxidation (TBARS), the increase of glutathione content and antioxidant defense system enzyme (SOD, CAT, GPx) to values close to normal. The hepatoprotective effect was confirmed by liver histological analysis. For acute toxicity evaluation in mice, ethanolic and aqueous extracts showed mild signs of kidney and liver toxicity in highest doses (300 and 2000 mg/kg p.o.) when administered as a single dose. In vitro anti-inflammatory activity, evaluated by RAW264.7 cells nitric oxide production, was demonstrated by chloroform fraction and polyamide-filtered chloroform fraction (100 ?g/mL) (50% inhibition), and the three isolated glycosides (6S,9S)-roseoside, byzantionoside B and blumenol C glucoside (30% inhibition) (50 ?g/mL). TNF-? production by these cells was inhibited by polyamide-filtered aqueous extract, polyamide-filtered ethanol extract and polyamide-filtered ethyl acetate fraction (100 ?g/mL) with 5h of LPS stimulation. Antimicrobial activity was evaluated by minimum inhibitory concentration. The samples tested showed no activity towards Leishmania braziliensis and Trypanossma cruzi. In the antifungal test, ethyl acetate (MIC = 64 ?g/mL), hexane (MIC =256 ?g/mL) and chloroform (MIC = 256 ?g/mL) fractions showed activity against C. albicans, and the first two were also active against C. parapsilosis (MIC = 16 and 64 ?g/mL respectively). Aqueous and ethanolic extracts showed activity against the Gram positive bacteria S. aureus (MIC = 39 and 78 ?g/mL respectively) and E. faecalis (78 ?g/mL), and reduced activity against the Gram-negative bacteria E. coli and P. aeruginosa. Ethyl acetate fraction showed activity against both types of bacteria. No sample was cytotoxic against KB and MRC5 cells. No hemolytic activity was recorded either, so these fractions do not seen to be toxic. These results encourage further research with R. induta leaf extracts and these extracts can be considered as promising in the context of new drugs research and development. Keywords: Rourea induta, anti-inflammatory, hepatoprotection, toxicity, antimicrobial