Nocaute de proteínas positivamente reguladas nas fases iniciais da metaciclogênese de Trypanosoma cruzi provoca a diminuição da capacidade proliferativa e de diferenciação do parasita

Abstract

Resumo : A Doença de Chagas, causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, ocorre na América Central e do Sul. Estima-se que 16 a 18 milhões de pessoas estão acometidas por esta patologia, sendo responsável por 21 mil de mortes a cada ano. Até o presente momento não há vacina ou medicamento eficiente para a sua fase crônica. O T. cruzi possui um ciclo de vida complexo, com um hospedeiro invertebrado e um hospedeiro mamífero, incluindo o homem. É na porção final do tubo digestivo do inseto que ocorre a metaciclogênese, com a diferenciação do T. cruzi de uma forma replicativa e não-infectiva (epimastigota) para uma forma infectiva e não-replicativa (tripomastigota metacíclico). Tal processo envolve alterações na expressão de diferentes genes associados com a aquisição de infectividade e virulência pelo parasita. O presente trabalho objetivou, inicialmente, a construção de cassetes de nocaute gênico, obtenção de parasitas nocaute e realização de ensaios funcionais preliminares (viabilidade celular, capacidade de proliferação e diferenciação) para quatro proteínas diferencialmente expressas durante a metaciclogênese de T. cruzi, além da pesquisa em bancos de dados e do uso de ferramentas bioinformáticas para o levantamento de domínios estruturais e informações funcionais disponíveis para as mesmas. Duas proteínas, anotadas como hipotéticas conservadas, não possuem nenhuma indicação funcional; outra tem função putativa de diidrolipoamida desidrogenase; e a última proteína, apesar de anotada como hipotética conservada, possui domínios de ligação e reconhecimento de RNA eucariótico. Análises bioinformáticas indicaram que os genes codificadores das proteínas estudadas seriam de cópia única no genoma, tornando-as passíveis de depleção por nocaute gênico. Para todas as proteínas estudadas, foram construídos cassetes de nocaute gênico para os dois alelos (quatro cassetes contendo NEO e quatro cassetes contendo HIGRO). Foram obtidos parasitas nocaute simples viáveis para as quatro proteínas. Entretanto, em função do tempo viável para execução do projeto, as demais etapas do trabalho foram direcionadas para apenas duas proteínas. Para esses dois nocautes simples foram realizados ensaios funcionais preliminares, os quais apontaram redução na capacidade proliferativa e de diferenciação e; obtidos parasitas duplos transfectantes, os quais também se apresentaram viáveis. Objetivando isolar populações clonais para estudos mais aprofundados, realizou-se o Cell Sorting em placas de 96 poços. Para uma das proteínas foram obtidas 61 colônias, enquanto para a segunda foram obtidas 72 colônias. Experimentos iniciais para confirmação do duplo nocaute dos genes de interesse demonstraram que, para a primeira proteína, apesar de confirmada a inserção dos cassetes de nocaute para os dois alelos, houve a amplificação da CDS do gene de interesse e assim, não se verificou a obtenção de nocaute duplo. Já para a segunda proteína foram observadas cinco colônias sem amplificação da CDS do gene de interesse e, assim, acredita-se que houve a obtenção de parasitas duplo nocaute. Em síntese, o presente trabalho resultou na produção de cassetes para nocaute gênico de quatro proteínas possivelmente envolvidas no processo de metaciclogênese de T. cruzi, bem como de cepas nocaute do parasita para duas delas, as quais apresentaram diminuição na capacidade de proliferação e de diferenciação. Essas cepas são de grande importância para a caracterização funcional das proteínas.