Efeito de lipossomos peguilados e constituídos de fósfatidilserina na artrite experimental crônica

Abstract

Resumo: A Artrite reumatoide (AR) é uma doença auto-imune inflamatória, que acomete as articulações, promovendo acúmulo de células na região sinovial, danos na cartilagem e formação de pannus. Nos últimos anos o emprego de lipossomos constituídos de fosfatidilserina (LFS), demonstrou reduzir a inflamação em modelos animais de artrite aguda, supostamente por mimetizar o processo da apoptose. Esta nova alternativa surge como possível terapia da AR. Objetivo: A pesquisa teve por objetivo avaliar a eficácia de lipossomos peguilados e constituídos de FS (LPeg-FS) em modelo de artrite experimental crônica, utilizando camundongos com artrite induzida por colágeno bovino tipo II (CIA) e sua ação imunomoduladora em in vitro. Método: A artrite foi induzida nos camundongos (n=24) por CIA no dia zero. No 18° dia, após a imunização, os animais receberam o booster. O tratamento iniciou-se no mesmo dia do booster, com administrações subcutâneas (s.c.) diárias no período de 20 dias. Foram constituídos quatro grupos experimentais; grupo 1 sem tratamento - solução salina (n=6), grupo 2 tratado com LPeg-FS numa concentração de 5 mg/kg (n=6), grupo 3 tratado com 10 mg/kg (n=6) e grupo 4 tratado com 15 mg/kg (n=6). Análise da oxidação de LPEg-FS por CLAE, escore clínico de gravidade, incidência da doença, peso dos animais e dosagens de citocinas das articulações dos joelhos dos animais foram avaliadas. Para análise da imunomodulação de LPeg-FS, foi realizado um estudo in vitro com culturas de macrófagos estimulados com lipopolissacarídeo (LPS)/Acetato de miristato de forbol (PMA). Para esse experimento foram formados seis grupos; cultura sem tratamento (G1), PBS (G2), 100 ?M de LPeg-FS (G3), LPS/PMA (G4), LPS/PMA e PBS (G5) e LPS/PMA e LPeg-FS (G6). Resultados: LPeg-Fs nas doses de 10 mg/kg e 15 mg/kg não foi eficiente em reduzir o escore da doença nos animais. No entanto, o grupo LPeg-FS 5 mg/kg não apresentou o estágio mais avançado da doença, em comparação ao controle. Nas amostras das articulações dos joelhos coletados após o tratamento, os grupos LPEg-FS 15 mg/kg e 10 mg/kg, reduziram significativamente IL-6, IL-2, IFN-? e TNF-?, respectivamente, mesmo apresentando um elevado escore clínico. Os experimentos não apresentaram uma relação entre a diminuição dessas citocinas com TGF-?1 no estudo in vivo. A Incidência da doença e peso dos animais não foram afetadas pelo tratamento. Na concentração 100 ?M de LPeg-FS não se verificou a redução da inflamação instaurada por LPS/PMA no estudo in vitro. A presença de produtos oxidados na solução de LPeg-FS foi observada. Conclusão: A resolução da doença in vivo e do processo inflamatório in vitro não foi observada. No entanto, LPeg-FS demonstrou regular a produção de TNF-? (LPeg-FS 10 mg/mL) e IL-6, IL-2, IFN-? (LPeg-FS 15 mg/kg) nas articulações dos joelhos dos animais acometidos pela doença, por uma via de ação ainda desconhecida, aparentemente não relacionada com TGF-?1 e IL-10. Porém, tal efeito não repercutiu na melhora clínica dos animais. Novos estudos empregando novas dosagens e vias de administração alternativas, precisam ser realizados para avaliar a intervenção terapêutica de LPeg-FS em modelo experimental CIA.

Abstract: Rheumatoid Arthritis (RA) is an autoimmune inflammatory disease that affects the joints, promoting accumulation of synovial cells, cartilage damage and pannus formation. In recent years the use of phosphatidylserine-containing liposomes (PSL), showed reduced inflammation in animal model with acute inflammatory arthritis, presumably by apoptosis mimicry. This new alternative arises as a possible therapy against RA. Objective: The study aims to evaluate the effect of phosphatidylserine-containing pegylated liposomes (PS-PEGL) in mice with collagen-induced arthritis bovine type II (CIA) and its immunomodulating effects in vitro. Methods: Arthritis was induced in mice (n= 24) with bovine type II collagen (CII) on day zero. On the 18th day after immunization, the animals received booster. Treatment was initiated on the same day of the booster, with subcutaneous administration (s.c.) daily for 20 days. Four experimental groups were employed; untreated group - saline (n= 6) Group treated with PS-PEGL 5 mg/kg (n= 6), group treated with 10 mg/kg (n= 6) and treated group with 15 mg/kg (n= 6). PS-PEGL oxidation analysis by HPLC, clinical score, disease incidence, animal weight and cytokines of the knee joints of animals (IL-?1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-?, TNF-?, IL-17A, IL-10, TGF- ?1) in vivo and in vitro were employed. For analysis of immunomodulation of liposomes, a study was conducted in vitro with macrophages stimulated with LPS/PMA. Six experimental groups were formed, culture without treatment (G1), PBS (G2), PS-PEGL 100 ?M (G3), LPS/PMA (G4), LPS/PMA and PBS (G5) and LPS/PMA and PS-PEGL 100 ?M (G6). Results: PS-PEGL 10 mg/kg and 15 mg/kg was not effective in reducing the score of the disease in animals. However PS-PEGL 5 mg/kg was significant to prevent the animals did not show the advanced stage of the disease compared to the control. Samples collected from the knee joints after treatment, the groups PS-PEGL 15 mg/kg and 10 mg/kg, significantly reduced IL-6, IL-2, IFN-? and TNF-?, respectively, even with a high clinical score. The experiments did not show a relationship between the decrease these cytokines and TGF-?1. Incidence and weight of the animals were not affected by treatment. In vitro, PS-PEGL 100 ?M not verified the reduction of inflammation stimulated by LPS/PMA. Oxidized products in solution PS-PEGL was observed. Conclusion: In vivo and in vitro inflammation resolution through PS-PEGL was not observed, however PS-PEGL showed regulate at late stage of the disease TNF-? (PS-PEGL 10 mg/kg) and IL-6, IL-2 and IFN-? (PS-PEGL 15 mg/kg) production in the knee joints of mice, through a yet unknown mechanism of action apparently not related to TGF-?1 and IL-10. Further studies with new concentrations of PS-PEGL and alternative routes of liposomes administration need to be performed to evaluate the PS-PEGL therapeutic intervention in RA.