Produção de insumos para imunodiagnóstico de herpesvírus bovino 1 e 5

Abstract

Resumo: As infecções causadas por herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5), membros da família Herpesviridae, têm sido associadas a apresentações clínicas e subclínicas nesta espécie animal. As similaridades genômica e antigênica entre ambos representam um grande desafio para o diagnóstico laboratorial destas infecções. Os objetivos do presente estudo foram inicialmente identificar duas cepas (A e B), isoladas de casos clínicos, pelas técnicas de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Análise de Enzima de Restrição (REA) utilizando o gene da glicoproteína C (gC) e enzima BglI, respectivamente. Os amplicons obtidos para as referidas amostras apresentaram bandas em torno de 572 a 575 pb, respectivamente. Na REA, a amostra B apresentou dois fragmentos (333 pb e 239 pb) enquanto que a amostra A permaneceu com um único fragmento de aproximadamente 572 pb. O sequenciamento parcial dos genes da gC revelou 572 nucleotídeos para a amostra A compatível com o BoHV-1 do sub tipo 1.1. A amostra B indicou 575 nucleotídeos e foi agrupada com o BoHV-5. Na segunda etapa deste estudo a amostra B foi utilizada para produzir 61 hibridomas produtores de anticorpos monoclonais (AcMc) anti-BoHV-5 dos quais apenas dois (8E11 e 3B2) reagiram com a cepa BoHV-5 sendo tal reação revelada pelo teste de imunoperoxidase (IPX). A última etapa deste trabalho referiu-se à construção de um plasmídeo recombinante para a expressão da proteína gG126 do envelope da cepa A (BoHV-1). Os primers desenhados foram amplificados, clonados e expresso em E. coli. A atividade da proteína produzida foi testada frente a soros bovinos positivos, hiperimunes e negativos contra BoHV-1. Soros hiperimune e AcMc anti-BoHV-5 também foram testados. A proteína recombinante mostrou reatividade frente aos soros bovinos positivos e hiperimune anti-BoHV-1, bem como ao soro hiperimune anti-BoHV-5. No entanto, não foi reconhecida quando submetida a soro anti-BoHV-1 negativo e anticorpos monoclonais anti-BoHV-5. Conclui-se, a partir dos resultados obtidos, que as técnicas moleculares são importantes ferramentas para caracterização de cepas de BoHV-1 e BoHV-5. Além disso, os AcMc anti-BoHV-5 e a proteína recombinante gG126 do BoHV-1 produzidos representam potenciais insumos para o desenvolvimento de testes diagnósticos visando estratégias futuras para o controle e prevenção das infecções pelos herpesvírus destes tipos.

Abstract: The infections caused by bovine herpesvirus type1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5), Herpesviridae Family members, have been associaded with clinical and subclinical presentations in this animal species. The genomic and antigenic similarities between both represent a great challenge to the diagnostic laboratory of these infections. Initially, the presente study aimed identify two strains (A and B), isolated from clinical cases, by Polymerase Chain Reaction (PCR) and Restriction Enzyme Analyses (REA) using glycoprotein C (gC) gene and BglI, respectively. The referred samples had amplicons with band with 572 to 575 pb, respectively. In REA, the sample B generated two fragments (333 pb and 239 pb), while the sample A had only one fragment of 572 pb. The parcial sequencing of gC genes showed 572 nucleotides to the sample A, compatible with BoHV-1 subtype 1.1. The sample B revealed 575 nucleotides and was related with BoHV-5. In the second step of this study the sample B was used to produce 61 anti-BoHV-5 monoclonal antibodies (Mabs) hybridomes producers from which only two (8E11 e 3B2) were reagents with the BoHV-5 strain. This reaction was revealed by immunoperoxidase (IPX). The last step from this work was referred to the recombinat plasmid construction to the strain A (BoHV-1) envelope protein gG126 expression. The designed primers were amplified, cloned and expressed in E. coli. The protein activity was tested using positive, hyperimmune and negative bovines sera against BoHV-1. Hyperimmune sera and Mabs anti-BoHV-5 were also tested. The recombinant protein showed reactivity against positive and hyperimmune anti-BoHV-1 sera, and against hyperimmune BoHV-5. However, the recombinant protein wasn't recognised when submitted to the negative anti-BoHV-1 serum and anti-BoHVp-5 Mabs. From these results, it is possible to concluse that molecular techniques are important tools for the BoHV-1 and BoHV-5 strains characterization. Also, the produced anti-BoHV-5 Mabs and the BoHV-1 recombinant gG126 protein represent potencial products to the development of diagnostic tests aiming future estrategies to the control and prevention from these herpesvirus types infections.