Caracterização e nocaute do gene TcNUP-1 em Tryapanosoma cruzi

Abstract

Resumo : Estima-se, que somente no Brasil, 5 milhões de pessoas padeçam da Doença de Chagas. O agente etiológico dessa doença é o Trypanosoma cruzi, um organismo unicelular que possui um complexo ciclo de vida passando por dois organismos hospedeiros, um vertebrado e outro invertebrado, além de possuir quatro formas celulares de desenvolvimento principais: amastigotas, epimastigotas, tripomastigotas sanguíneos e tripomastigotas metacíclicos. O Trypanosoma cruzi pode ser classificado como um organismo eucarionte, da ordem Cinetoplastida, da família Tripanossomatideae. O genoma principal do T. cruzi se encontra no núcleo, que apresenta uma organização estrutural similar à encontrada em outras células eucarióticas. Entretanto é possível observar alterações na forma nuclear e nos níveis de compactação da cromatina durante os diferentes estágios celulares do ciclo do parasita. As associações observadas entre o envoltório nuclear e a cromatina periférica sugerem que as proteínas da lâmina nuclear são importantes para essa interação, fornecendo sítios de ancoragem para a cromatina na periferia nuclear e dessa forma atuam regulando a expressão de genes situados nesses loci. Tripanossomatídeos não possuem laminas, mas apresentam proteínas distintas que poderiam exercer as mesmas funções. Estudos preliminares realizados no Laboratório de Biologia Molecular de Tripanossomatídeos, do Instituto Carlos Chagas – FIOCRUZ, levaram a caracterização da proteína TcNUP-1 como uma das proteínas de lâmina nuclear em T. cruzi. Nesse contexto com intuito de conhecer melhor qual a função da proteína TcNUP-1, foram realizadas tentativas de nocautear ambos alelos do gene, bem como foi efetuado o sequenciamento do locus no qual o gene alvo desse estudo está inserido. Ao sequenciar o locus encontrou-se uma cópia adicional do gene TcNUP-1 todavia, em uma forma "truncada" que não contém todos os domínios do gene completo, tal fato ainda não havia sido relatado na literatura. Apesar de ser uma cópia incompleta, foi possível identificar um mRNA correspondente à mesma sendo transcrito nas formas epimastigotas da cepa Dm28c e alvo de trans-splicing. Não obstante, mais estudos devem ser realizados a fim de caracteriza-la. Ademais se conclui que no locus do gene TcNUP-1, diferente do observado no banco de dados, existe outra cópia do gene PEPCK a jusante da cópia truncada de TcNUP-1. Foi possível confirmar a deleção de somente um dos alelos. Por este motivo a transfecção para nocaute do segundo alelo deve ser repetida para que haja deleção completa da proteína e assim possa ser observado o fenótipo resultante. Não foi possível confirmar a caracterização do gene como sendo de cópia única com duas formas alélicas, embora existam fortes evidências corroborando essa hipótese.