Imunolocalização da actina 1 fusionada a etiqueta HA em formas epimastigotas de Trypanossoma cruzi

Abstract

Resumo : Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, responsável pela infecção de milhões de pessoas no mundo, principalmente na América Latina. Uma vez que esse parasita se desenvolve através de um ciclo de vida complexo envolvendo o trato digestivo de insetos vetores e o interior das células hospedeiras de mamíferos, está sujeito a estresses ambientais que exigem drásticas mudanças morfológicas e fisiológicas. No entanto, algumas proteínas classicamente relacionadas ao citoesqueleto, tais como a actina, permanecem ainda pouco investigadas em T. cruzi. Aspectos únicos na organização genômica deste protozoário parecem dificultar a completa caracterização da actina e diversas outras proteínas. A actina é a proteína mais abundante na maioria das células e desempenha um papel essencial na estrutura e dinâmica celular, participando de processos como mobilidade e manutenção da forma. Dentro deste contexto, o presente estudo visa identificar os genes que codificam a proteína actina 1 no genoma do T. cruzi e produzir parasitas geneticamente modificados expressando a actina recombinante fusionada a uma etiqueta para posterior imunolocalização. Para isso, foi realizada uma análise in silico das sequências das actinas encontradas nos bancos de dados disponíveis para consulta. Genes que codificam cinco isoformas de actina foram identificados. As análises mostraram que a actina 1 quando comparada as actinas de outros organismos possui mais de 50% de homologia, se mostrando uma proteína altamente conservada, inclusive em T. cruzi. A sequência da actina 1 foi então inserida em um cassete contendo uma etiqueta conhecida para imunolocalização no parasita. Após a transfecção e seleção dos parasitas, os mesmos foram observados pelo método de imunofluorescência indireta. Os resultados obtidos mostraram que a actina 1 encontra-se predominantemente na região posterior do parasita, diferindo do que foi observado em estudos anteriores utilizando soro policlonal, que descreveram um padrão de marcação disperso pelo corpo do parasita. Juntos, os resultados deste trabalho mostraram que a combinação de métodos clássicos e modernos de clonagem para a obtenção de parasitas expressando proteínas fusionadas à etiquetas comerciais permite uma avaliação mais específica da localização de diferentes isoformas de uma mesma proteína em T. cruzi. Este trabalho abre um leque de possibilidades no estudo da localização e do papel de cada uma das isoformas da actina em T. cruzi.