Development of a biotreatment for delignification of sugarcane bagasse and production of laccases

Abstract

Resumo: A valorização de agro-resíduos por rotas biológicas é uma tecnologia chave que contribui para o desenvolvimento de processos sustentáveis e para a geração de produtos de alto valor agregado. O bagaço de cana é um agro-resíduo lignocelulósico produzido em grandes quantidades pela indústria sucroalcooleira no Brasil. A utilização do bagaço de cana como matéria-prima tem sido limitada pela presença de lignina e hemiceluloses, que restringem a hidrólise eficiente da celulose. A deslignificação é um pré-tratamento necessário no processo de conversão da biomassa vegetal em açúcares fermentescíveis. A degradação biológica da lignina pode ser realizada pelos fungos da podridão branca, que produzem enzimas oxidativas, especialmente lacases, manganês peroxidases e lignina peroxidases. As lacases recebem muita atenção pois oxidam tanto compostos fenólicos como não fenólicos e usam oxigênio como aceptor final de elétrons. Elas apresentam muitas aplicações industriais relacionadas à oxidação de substâncias fenólicas. Os objetivos desta pesquisa foram: selecionar uma cepa de basidiomiceto capaz de degradar lignina e produzir lacase no bagaço de cana, e realizar sua identificação molecular por sequenciamento de DNA; otimizar a produção de lacase e determinar seu modelo matemático, pelo processo de fermentação sólida do bagaço de cana; avaliar o efeito de indutores e diferentes concentrações de nitrogênio no padrão de isoformas de lacases produzidas em fermentação sólida do bagaço de cana pela cepa selecionada; avaliar a cinética de deslignificação biológica do bagaço de cana pela cepa selecionada em fermentação sólida, sob condições otimizadas para a produção de lacase; recuperar e concentrar a lacase e realizar a deslignificação enzimática do bagaço de cana. Dentre 45 cepas de basidiomicetos, uma cepa de Pleurotus sp. apresentou atividade de lacase significativamente superior às demais cepas (183 U/L após 5 dias de crescimento em condição semi-sólida). A região ITS do rDNA fúngico foi amplificada por PCR e a cepa foi identificada como Pleurotus ostreatus pela análise da sequência ITS1-5.8rDNA-ITS2. A produção de lacase pela cepa selecionada de P. ostreatus foi avaliada em fermentação sólida do bagaço de cana e o pico de atividade enzimática foi atingido ao 5º dia de fermentação (2.05 U/g). Dentre oito variáveis, as concentrações de CuSO4 e (NH4)2SO4 demonstraram influenciar significativamente a produção de lacase. A substituição do sulfato de amônio por extrato de levedura e a adição de ácido ferúlico como indutor conferiram aumentos de 5,7 e 2,0 vezes, respectivamente, na produção de lacase. A otimização da produção de lacase como função das concentrações de extrato de levedura, sulfato de cobre e ácido ferúlico foi realizada pela metodologia da superfície de resposta e as concentrações ótimas foram 6,4 g/L, 172,6 ?M e 1,86 mM, respectivamente, e a atividade máxima de lacase prevista pelo modelo (R² 0,8753) foi de 161,3 U/g. Experimentalmente, a máxima atividade de lacase de 151,6 U/g foi produzida ao 5º dia de fermentação no estado sólido. Zimogramas indicaram a presença de seis isoformas de lacases (POXA1b, POXA3, POXC e três outras isoformas). Os resultados de identificação protéica por espectrometria de massa confirmaram a presença de POXC e POXA3 como as principais isoenzimas, e também identificaram uma glioxal oxidase e três galactose oxidases. O fato de a enzima POXA1b não ter sido identificada nas amostras analisadas pode ser possivelmente explicado por sua sensibilidade à degradação por proteases. O teor de lignina foi reduzido de 31,89% para 26,36% após 5 dias e para 20,79% após 15 dias pelo tratamento biológico de fermentação sólida. A hidrólise enzimática reduziu o teor de lignina de 31,89% para 14,98% em 12h.

Abstract: The valorization of agro-residues by biological routes is a key technology that contributes to the development of sustainable processes and the generation of value-added products. Sugarcane bagasse is a lignocellulosic agro-residue generated in high amount by the sugar and alcohol industry in Brazil. The utilization of sugarcane bagasse as a feedstock has been limited because of the presence of lignin and hemicelluloses that restrain the efficient hydrolysis of cellulose. Delignification is a necessary pretreatment step in the process of converting plant biomass into fermentable sugars. The biological degradation of lignin can be performed by white-rot fungi that produce oxidative enzymes, especially laccases, manganese peroxidases and lignin peroxidases. Laccases receive much attention since they oxidize both phenolic and non-phenolic compounds and use oxygen as the final electron acceptor. They present many industrial applications related to the oxidation of phenolic substances. The objectives of this research were: to select a strain of basidiomycete able to degrade lignin and produce laccase in sugarcane bagasse and to perform its molecular identification by DNA sequencing; to optimize the production of laccase and to determine its mathematical model, through the process of solid state fermentation of sugarcane bagasse; to evaluate the effect of inducers and different concentrations of nitrogen on the pattern of laccase isoforms, produced in solid state fermentation of sugarcane bagasse by the selected strain; to evaluate the kinetics of biological delignification of sugarcane bagasse by the selected strain on solid state fermentation, under optimized conditions for laccase production; to recover and concentrate laccases and perform the enzymatic delignification of sugarcane bagasse. Among 45 strains of basidiomycetes, one of Pleurotus sp. presented a laccase activity significantly higher than all the other strains (183 U/L after 5 days of growth in semi-solid condition). The ITS region of the fungal rDNA was amplified by PCR and the strain was identified as Pleurotus ostreatus through ITS1-5.8rDNA-ITS2 sequence analysis. The production of laccase by the selected P. ostreatus was evaluated in solid state fermentation of sugarcane bagasse and the peak of enzymatic activity was reached at the 5th day of fermentation (2.05 U/g). Among eight variables, CuSO4 and (NH4)2SO4 concentrations demonstrated to significantly influence laccase production. The replacement of ammonium sulfate by yeast extract and the addition of ferulic acid as inducer provided increases of, respectively, 5.7 and 2.0 fold in laccase production. Optimization of laccase production as a function of yeast extract, copper sulfate and ferulic acid concentrations was performed by response surface methodology and optimal concentrations were 6.4 g/L, 172.6 ?M and 1.86 mM, respectively, the maximum laccase activity predicted by the model (R² 0.8753) being 161.3 U/g. Experimentally, the maximum laccase activity of 151.6 U/g was produced at the 5th day of solid state fermentation. Zymograms indicated the presence of six laccase isoforms (POXA1b, POXA3, POXC and three other isoforms). Results of protein identification by mass spectrometry confirmed the presence of POXC and POXA3 as the main isoenzymes, and also identified a glyoxal oxidase and three galactose oxidases. The fact that the isoenzyme POXA1b was not identified in the analyzed samples can be possibly explained by its sensitivity to protease degradation. Lignin content was reduced from 31.89% to 26.36% after 5 days and to 20.79% after 15 days by the biological treatment of solid state fermentation. Enzymatic hydrolysis reduced the lignin content from 31.89% to 14.98% in 12h.