Produção de proteínas recombinantes ESAT-6, CFP-10 e MTSP-11

Abstract

Resumo: A tuberculose bovina (TB) é causada pelo Mycobacterium bovis e aflige rebanhos em vários países do mundo. Estima-se que a doença leva a perdas anuais de três bilhões de dólares na agropecuária mundial, além da sua importância para a saúde pública. A prevalência e incidência da doença vêm decaindo nos últimos anos como resultado direto de programas de erradicação e controle de tuberculose. No Brasil, a TB é endêmica e o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento criou em 2001 o programa brasileiro de controle desta doença. Neste programa, a principal ferramenta para o diagnóstico é o teste alérgico-cutâneo, que apresenta dificuldades técnicas de produção pelo lento crescimento do microrganismo. A fim de aprimorar esta tecnologia, a utilização de antígenos recombinantes mostra-se como alternativa promissora. O presente trabalho teve por objetivo a produção das proteínas recombinantes ESAT-6, CFP-10 e MTSP-11 por fermentação de Escherichia coli e purificação através de metodologias aplicáveis industrialmente. Para redução do tempo de escalonamento, foi padronizada uma metodologia de produção de préinóculos transformados, que permaneceram estáveis por um ano quando mantidos a - 80°C. O processo de fermentação e produção das proteínas recombinantes foi realizado em agitador de bancada a 37°C e 200 rpm por 3 horas, levando à expressão das proteínas na forma de corpos de inclusão. Estes corpos foram solubilizados em tampão com uréia e purificados por cromatografia de afinidade em resina de níquel após rompimento celular por sonicação. As proteínas foram eluídas com alta pureza, e suas concentrações foram padronizadas por ultrafiltração. Ao final do processo, obteve-se altos rendimentos proteicos, 23,9 mg, 22,7 mg e 143,5 mg por litro de fermentado para as proteínas ESAT-6, CFP-10 e MTSP-11, respectivamente. O alto rendimento obtido e a simplicidade dos processos de fermentação e purificação tornam a metodologia aplicável industrialmente. Estes insumos têm aplicação em diagnósticos com alta especificidade e em vacinas com capacidade de diferenciação de resposta vacinal e infeccional, seguindo as novas tendências nos diagnósticos de tuberculose bovina e humana.

Abstract: Bovine tuberculosis (TB) is caused by Mycobacterium bovis and afflicts livestock in many countries over the world. It is estimated that the disease leads to annual losses of three billion dollars in world agricultural livestock, besides its importance to public health. The prevalence and incidence of the disease have been declining in recent years as a direct result of eradication and control programs of tuberculosis. In Brazil, TB is endemic and the Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento created in 2001 the brazilian program to control this disease. In this program, the main tool for diagnosis is the skin test, which presents technical difficulties in production caused by the slow growth of the microorganism. To improve this technology, the use of recombinant antigens appears as a promising alternative. The present study aimed the production of recombinant proteins ESAT-6, CFP-10 and MTSP-11 by fermentation of Escherichia coli and purification through industrially applicable methodologies. In order to reduce the scale-up time, a methodology for production of transformed pre-inocula was standardized, which were stable for one year when stored at - 80°C. The fermentation process and production of recombinant proteins was performed in shaker at 37°C and 200 rpm by 3 hours, leading to expression of the proteins as inclusion bodies. These bodies were solubilized in buffer containing urea and purified by affinity chromatography on nickel resin after cell disruption by sonication. The proteins were eluted with high purity, and their concentrations were standardized by ultrafiltration. At the end of the process, high yields of protein were obtained, 23.9 mg, 22.7 mg and 143.5 mg per liter of fermentation for the proteins ESAT-6, CFP-10 and MTSP-11, respectively. The high yield and simplicity of the fermentation and purification processes makes the methodology applicable industrially. These antigens have application in diagnostics with high specificity and vaccines capable of vaccine and infection responses differentiation, following the new trends in human and bovine tuberculosis diagnoses.