Efeito de dois métodos de resfriamento sobre a funçao espermática in vitro de semen criopreservado de felinos (Leopardus tigrinus, Leopardus pardalis E Felis catus), avaliada através de ensaio competitivo de ligaçao em ovócitos de gata doméstica (Felis catus)

Abstract

A busca de estratégias eficientes para a manutenção de espécies em risco de extinção tem impulsionado a comunidade científica a pesquisar alternativas para a preservação de material genético, com intuito de formação de bancos de genoma e aplicação de biotécnicas reprodutivas. Este estudo teve por objetivo avaliar os efeitos de dois protocolos diferentes de resfriamento pré-congelamento para a criopreservação de sêmen de jaguatirica (n=3), gato-do-mato-pequeno (n=4) e gato doméstíco (n=15). Apenas seis amostras de sêmen de jaguatirica, sete de gato-do-mato-pequeno e treze amostras de gato doméstico apresentaram características qualitativas e quantitativas para serem submetidas aos dois métodos de resfriamento. Estas amostras foram processadas e diluídas em meio crioprotetor, com 4% de glicerol e divididas em duas alíquotas submetidas ao método rápido (30 min a 4°C) ou lento (= 2 horas a 4°C) de resfriamento e, em seguida congeladas. Após o descongelamento as amostras foram avaliadas para índice de motilidade, percentual de células com acrossoma intacto e de células viáveis. Ovócitos de gatas domésticas maturados in vitro foram utilizados para avaliar a capacidade de ligação espermática à zona pelúcida, em ensaios de ligação competitiva in vitro. Os espermatozóides criopreservados pelos dois métodos, diferenciados entre si pelo uso de corante vital, competiram pela ligação à zona pelúcida dos mesmos ovócitos, em iguais condições de tratamento. O índice médio da motilidade espermática, pós-congelamento, foi de aproximadamente 50% para todas as espécies nos dois métodos de resfriamento. O percentual de células com acrossoma intacto, para a jaguatirica, foi de aproximadamente 20% nos dois métodos de resfriamento enquanto o gato-do-mato-pequeno apresentou 30,8% de células com acrossoma intacto no método de resfriamento rápido e 33,4% no método lento. Para o gato doméstico, o percentual de células com acrossoma intacto foi de 33,4% e 32,7% nos métodos de resfriamento rápido e lento, respectivamente. O sêmen do gato-do-mato-pequeno sofreu a menor redução no percentual de células viáveis com 51,2% no método de resfriamento rápido e 44% no método lento. A jaguatirica apresentou os menores índices entre as três espécies com 24% de células viáveis no método rápido e 27,4% no método lento, e o gato doméstico apresentou 28,6% e 28,2% de células viáveis nos métodos rápido e lento, respectivamente. O número médio de espermatozóides ligados por ovócito foi maior (p < 0,05) para o resfriamento lento do sêmen de gato-do-mato-pequeno (5,8 +- 0,9) do que para o resfriamento rápido (2,7 +- 0,4). Já o resfriamento rápido proporcionou melhores resultados na taxa de ligação espermática para a jaguatirica (8,5 +- 1,3) (p < 0,01) e para gato doméstico (4,3 +-0,9) (p< 0,05), enquanto o método de resfriamento lento proporcionou 2,5 +- 0,3 espermatozóides de jaguatirica e 1,4 +- 0,2 espermatozóides de gato doméstico ligados por ovócito. As diferentes respostas entre as espécies podem ser devidas a características espermáticas espécie-específicas e individuais. Os resultados permitiram inferir que os protocolos de criopreservação devem ainda ser aperfeiçoados e adaptados à cada espécie e que o ensaio de ligação espermática competitiva foi eficiente na detecção de diferenças na função espermática entre tratamentos, o que não foi possível com as avaliações espermáticas de rotina

The search for efficient strategies to preserve species from extinction has stimulated scientists to develop alternative methods to preserve genetic material with the aim of establishing genome resource bankings and also the improvement of reproductive technologies. This study aimed to evaluate the effects of two different cooling protocols for the cryopreservation of sperm in ocelots (n=3) tigrinas (n=4) and domestic cats (n=15). Only six semen samples from tigrinas, seven from ocelots and thirteen ejacutates from domestic cats were high quality and allowed both cooling methods freezing. These samples were diluted with a 4% glycerol freezing medium, divided into two vials and assorted to one of the cooling rates (30 min at 4°C -fast method or = 2 h - slow method) before freezing. After thawing, samples were evaluated for sperm motility, percentage of intact acrosome cells and percentage of viable cells. In vitro matured domestic cat oocytes were used to assess the ability of sperm to bind to zonae pellucida in in vitro competitive sperm-binding assays. Spermatozoa from one of the treatments were stained with a vital fluorescent stain and sperm from both treatments competed for the same oocytes in equal co-incubation conditions. Sperm motility index after thawing was approximately 50% for all species in both cooling methods. The percentage of acrosome intact cels for ocelots was nearby 20% in both cooling methods while the tigrinas showed 30,8% acrosome intact cels in fast cooling method and 33,4% in slow method. For domestic cats the percentage of cels with acrosome integrity was 33,4% and 32,7% in fast and slow methods, respectively. The percentage of viable cells for tigrinas had the lowest reduction with 51,2% in fast cooling method and 44% in slow method. The ocelots showed the lowest index among three species with 24% of viable cels in fast method and 27,4% in slow method, and the domestic cat showed 28,6% and 28,2% of viable cels in fast and slow cooling methods, respectively. The average number of sperm binded per oocyte was higher (p < 0,05) for the slow cooling rate in tigrina semen (5.8 +- 0.9) than fast cooling method (2,7 +- 0,4). The fast cooling treatment provided better results in sperm binding for ocelots (8,5 +- 1,3) (p < 0,01) and for domestic cats (4,3 +- 0,9) (p< 0,05), while the slow cooling method favoured 2,5 +- 0,3 ocelot sperm and 1,4 +- 0,2 domestic cat sperm binded per oocyte. Differences between treatments within species might be the result of species-specific and/or individual differences in sperm cell structure and function. From this data we concluded that cryopreservation protocols must be still improved and adapted to species individually and also that the competitive sperm-binding assay was efficient to detect differences in sperm function between treatments, which was not possible from the routine sperm evaluation procedures used here