Organogênese in vitro e transformação genética de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla VIA Agrobacterium tumefaciens

Abstract

Resumo: Eucalyptus grandis x E. urophylla se destaca em plantios brasileiros devido às características que herdou de seus parentais, como qualidade da madeira para a produção de papel e celulose. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo de organogênese indireta com explantes foliares e aperfeiçoar aspectos da transformação genética mediante co-cultura com Agrobacterium tumefaciens. Para estabelecer o protocolo de organogênese indireta, na fase de calogênese, testaram-se diferentes concentrações de ANA e, em seguida, de TDZ combinado com ANA ou com 2,4-D no meio de cultura JADS por 30 dias, seguido de subcultura em meio de regeneração, contendo 5,0 ?M de BAP e 0,5 ?M de ANA por mais 30 dias. Nesses meios, os explantes tiveram alta oxidação. A fim de diminuir a oxidação, diferentes meios de cultura foram comparados: WPM, MS, JADS e QL. Obteve-se a maior porcentagem de regeneração e menor taxa de oxidação após cultura em meio WPM seguido de transferência a meio de regeneração. Assim, testaram-se ANA e 2,4-D combinado com TDZ, e em seguida, TDZ e BAP combinado com ANA no meio de cultura WPM. O tratamento mais eficiente em termos de regeneração de gemas foi o meio de cultura WPM e a combinação de 0,25 ?M de TDZ e 0,1 ?M de ANA por 30 dias para a calogênese e, em seguida, 5,0 ?M de BAP e de 0,5?M de ANA por outros 30 dias. Este protocolo proporcionou uma regeneração de brotos de até 46%, com uma baixa oxidação dos tecidos. Observou-se que a idade das brotações utilizadas como fonte de explantes não tinha efeito sobre a organogênese e que pode-se utilizar explantes de 3, 4 ou 5 semanas na última subcultura. Para determinar as concentrações dos agentes seletivos que seriam utilizadas durante a transformação genética, testaram-se diferentes concentrações de canamicina, glufosinato de amônio e manose combinada com sacarose. Os resultados mostraram que se deve iniciar a seleção das plantas transformadas com o gene nptII em 12,5 mg L-1 de canamicina; para plantas transformadas com o gene bar em 0,5 mg L-1 de glufosinato de amônio; para plantas transformadas com o gene pmi em 22,5 g de sacarose e 7,5 g de manose. Experimento visando testar Augmentin® e cefotaxima na eliminação de Agrobacterium tumefaciens também foi realizado. Na presença de Augmentin, os explantes formaram calos brancos e não oxidados, enquanto que, na presença de cefotaxima, os calos oxidaram. Para diminuir a oxidação imediata dos explantes transformados com o gene bar, esses foram deixados um mês sem glufosinato de amônio após a co-cultura, enquanto que no controle os explantes ficaram em meio de cultura com o agente seletivo. Neste experimento, todos os explantes do controle oxidaram e necrosaram, não formando calos, enquanto que os explantes que foram mantidos um mês sem glufosinato de amônio formaram calos. No entanto não houve regeneração de gemas o que impediu avaliar a eficiência da transformação genética. Além da transformação de explantes foliares com o gene bar, realizou-se transformação com o gene nptII, a qual originou brotações resistentes a 50 mg L-1 de canamicina.