Papel das metaloproteinases de matriz e seus inibidores do pontencial anti-tumoral da Sinvastatina em linhagens de glioma humano

Abstract

Resumo: Gliomas são os tumores mais comuns do sistema nervoso central, e em seu mais alto grau de malignidade (também chamado de glioblastoma multiforme - GBM) são tidos hoje como incuráveis, sendo a sobrevida nesses casos de no máximo 15 meses. Uma das principais causas da alta taxa de mortalidade é a elevada capacidade de invasão, processo realizado pelas metaloproteinases de matriz (MMPs). As principais MMPs envolvidas na invasão de gliomas são as MMPs 2, 9 e a MT1-MMP. As MMPs são inibidas principalmente por seus inibidores tissulares solúveis (TIMPs) ou RECK, uma glicoproteína ancorada a membrana. RECK está presente principalmente em microdomínos ricos em colesterol na membrana celular (lipid rafts) e é capaz de inibir através de diversos mecanismos as MMPs 2, 9 e a MT1-MMP. Recentemente, foi descrito um transcrito alternativo do gene RECK (RECKB), e evidências suportam que RECKB esteja relacionado a um fenótipo maligno. Já as TIMPs (4 em humanos) são proteínas solúveis e menos específicas. O balanço negativo MMPs/Inibidores é fundamental para o controle do processo invasivo, tornando importante a busca de compostos capazes de estimular esse balanço a favor dos inibidores. As estatinas são inibidores da enzima HMG-CoA redutase, fundamental na síntese de colesterol e isoprenóides, e são hoje muito utilizadas por pacientes com hipercolesterolemia. Recentemente, alguns autores associaram o uso das estatinas a uma menor incidência em diversos tipos de tumores (inclusive gliomas), pois proteínas fundamentais para a proliferação e invasão, como Ras e Rho, necessitarem de moléculas isoprenóides para ancorarem-se na parte interna da membrana e assim exercerem suas funções corretamente. Posto isso, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da sinvastatina na viabilidade, migração e parada de proliferação em linhagens de gliobastoma humano U87MG e T98G, e verificar a contribuição do balanço MMPs/Inibidores para o fenótipo anti-invasivo atribuído à sinvastatina. Primeiramente, nossos dados mostraram que a sinvastatina foi capaz de diminuir a viabilidade celular a partir de 48 horas de tratamento, causando a perda de em média 70% na maior dose (5?M) e maior tempo de tratamento (72 horas). Após 48 horas de tratamento com 1 e 5?M de sinvastatina, houveram alteações significativas na morfologia das duas linhagens, um aumento em torno de 20% de células na fase G1 na linhagem U87MG aumentando também o conteúdo de DNA fragmentado em ambas as linhagens, indicando morte celular. Ainda, houve uma diminuição significativa na migração das duas linhagens já a partir de 24 horas de tratamento. Os dados de expressão de mRNA mostraram, de modo geral, que o tratamento com a sinvastatina foi capaz de favorecer o balanço à favor das TIMPs em relação às MMPs 2, 9 e MT1-MMP. Não houve modulação de RECK canônico (RECKA), tanto da proteína, quanto do mRNA, mas o tratamento diminuiu significativamente os níveis de mRNA do transcrito alternativo RECKB. Ainda, a sinvastatina foi capaz de alterar a localização na membrana de RECK, podendo estar afetando a ação dessa proteína como inibidor de MMPs. Os dados obtidos nesse trabalho ressaltam a importância da sinvastatina como possível adjuvante na terapia anti-tumoral e mostraram que os inibidores de MMPs podem ter uma importante contribuição na contenção da invasão, auxiliando na busca a um melhor prognóstico para pacientes com tumores malignos da glia.

Abstract: Gliomas are the most common tumors of the central nervous system, and in the highest stage of malignancy (also named glioblastoma multiforme - GBM) are incurable. Patient survival in these cases is about 15 months, and a major cause of the mortality is the high invasiveness. The invasion process is due to a family of enzymes, the matrix metalloproteinases (MMPs). The main MMPs involved in glioma invasion are MMPs 2, 9 and the MMP anchored to membrane, MT1-MMP. MMPs are inhibited mostly by their tissue inhibitors (TIMPs) or RECK, a membrane anchored glycoprotein. RECK is situated at the lipid rafts in cell membrane, and is capable of inhibiting by several mechanisms the MMPs 2, 9, and MT1-MMP. Recently, it was described an alternative transcript of the RECK gene (RECKB), and evidences support that, opposed to the canonical transcript, RECKB is related to a malignant phenotype. The TIMPs (4 are known in humans) are soluble, less specific, where TIMP3 appears to have the broadest spectrum of inhibition and TIMP4 is a strong inhibitor of all MMPs. A negative balance MMPs/Inhibitors is critical for the control of invasive process, making important to search for compounds capable of stimulating this balance in favor of the inhibitors. Statins are inhibitors of the enzyme HMG-CoA reductase, essential in the synthesis of cholesterol and isoprenoids derivatives, and are largely used by patients with hypercholesterolemia. Recently, some authors start to associate the use of statins with a lower incidence of cancer in several tumor types (including gliomas). This is mostly due to a decrease of function of proteins essential for proliferation and invasion, such as Ras and Rho, which require isoprenoid derivatives to stay anchored inside the membrane and perform their functions correctly. Therefore, the goal of our study was to investigate the effects of simvastatin on viability, migration and proliferation in human glioblastoma cell lines (U87MG and T98G), and verify if the anti-invasive phenotype assigned to simvastatin induces a change in the balance MMPs/Inhibitors. First, our data showed that simvastatin was able to reduce cell viability after 48 hours of treatment, causing loss of approximately 70% at the highest dose (5?M) and longer duration of treatment (72 hours). Furthermore, the treatment significantly changed the morphology of the two cell lines after 48 hours in two doses used (1 and 5?M). It was observed an increase of about 20% of cells in G1 phase in cell line U87MG after 48 hours of treatment with increase of DNA fragmentation in T98G and U87MG cell lines. We also found a significant decrease in migration of the two cell lines in 24 hours of treatment, in a time and dose-dependent manner. In general, the treatment with simvastatin favored the balance of TIMPs/MMP2, 9 e MT1-MMPs to the inhibitors, in the mRNA level. There was no modulation of the canonical RECK (RECKA), in the protein and mRNA, but treatment significantly decreased the levels of RECKB mRNA. Simvastatin was able to change the location in the membrane of RECK, and this may be affecting the action of this protein as an inhibitor of MMPs. The data obtained in this study emphasize the importance of simvastatin as a potential adjuvant in anti-tumor therapy and showed that MMP inhibitors may have an important contribution in the containment of invasion assigned to simvastatin, helping in the search to a better prognosis for patients with malignant glial tumors.