Estudo do efeito antioxidante de polifenóis em eritrócitos de pacientes de hemoglobina S

Abstract

Resumo: A doença falciforme resulta de uma alteração genética que leva a distúrbios estruturais da hemoglobina e, consequentemente, da membrana do eritrócito e ao estresse oxidativo. O presente trabalho teve como objetivo correlacionar os parâmetros hematológicos com o status oxidativo e a ação protetora de flavonoides em eritrócitos de pacientes de anemia falciforme em seus haplótipos. Foram estudados 29 pacientes com anemia falciforme (grupo SS) atendidos no Centro de Hematologia e Hematoterapia do Paraná (HEMEPAR), submetidos à terapêutica com hidroxiureia (0,5 a 1,0 g/dia) e 15 individuos considerados normais (grupo AA). Foram determinados os haplótipos do cluster ?-globínico e a concentração de hemoglobina fetal (HbF) dos pacientes do grupo SS. A formação das Espécies Reativas de Oxigênio (ERO), porcentagem de hemólise, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), glutationa reduzida (GSH), metahemoglobina e glicose 6-fosfato desidrogenase (G6-PD) foram analisadas no estado basal e pela ação de dois agentes oxidantes (t-BHP e AAPH) tanto no grupo SS quanto no grupo AA. No grupo SS, observou-se o predomínio do haplótipo BAN (70%) em relação ao BEN (25,8%), em concordância com outros estudos realizados no Brasil em estados no quais houve tráfico de escravos das mesmas regiões da África. Foi encontrado 1 paciente com o haplótipo SEN. No grupo SS, a hemoglobina fetal basal mostrou-se elevada (10,9 ? 8,2%); houve maior tendência à oxidação demonstrada pela formação de metahemoglobina no estado basal (AA = 3,44? 0,38%; SS = 4,45?1,10%) e sob a ação de t-BHP (1mmol/l) (AA = 5,52 ? 1,77%; SS = 10,15 ? 4,12%); TBARS após ação de t-BHP (2 mmoles/l) (AA= 177,13 ? 76,44 SS = 374,18? 144,08 nmoles/gHb); não houve alterações nos níveis de GSH no estado basal (AA = 7,94?1,38 mU/gHb; SS = 7,78 ? 2,29 mU/gHb), mas houve consumo de GSH após ação de t-BHP (2 mmoles/l) (AA = 0,50 ? 0,36; SS = 1,02? 0,84 mU/gHb). Observou-se ainda, atividade aumentada de G6-PD no estado basal (AA = 6,39?0,90; SS = 13,01?4,75 mU/gHb) e seu maior consumo após adição de t-BHP (3 mmoles/l) (AA = 4,99?0,70; SS = 5,25?2,84 mU/gHb). Em subgrupos formados pelos haplótipos BEN/BAN (n=11), BAN/BAN (n=15) e BEN/BEN (n=2) não se encontrou diferenças significativas no comportamento oxidativo. Em concentrações que variaram entre 30 a 200 ?moles/l, os flavonoides quercetina, rutina, miricetina e hesperidina foram eficientes na proteção da formação de ERO, TBARS e hemólise, sem contudo mostrarem efetividade na proteção contra o estresse oxidativo ao se analisar níveis de metehemoglobina, consumo de GSH e atividades de G6-PD, sem diferenças entre os subgrupos estudados. Os resultados indicaram tendência à exacerbação do processo oxidativo em eritrócitos de pacientes com anemia falciforme, sem diferenças entre os subgrupos BEN/BAN, BAN/BAN e BEN/BEN. No entanto, os eritrócitos do paciente com o haplótipo SEN/SEN mostraram indícios de maior resistência ao estresse oxidativo. Os flavonoides apresentaram proteção ao estresse oxidativo na membrana eritrocitária (quercetina>rutina>miricetina>hesperidina) como verificado pelos valores de ERO, hemólise e TBARS. Os resultados obtidos para metahemoglobina, GSH e G6-PD não indicaram mesma proteção, o que poderia ser explicado pela pequena penetração dos mesmos no citosol do eritrócito. Pela comparação entre os resultados para os subgrupos, a variabilidade genética não é fator que tenha influência sobre a resposta dos flavonoides. O uso da hidroxiureia pode ter influenciado os resultados encontrados neste trabalho, visto que a formação de ERO foi compatível com a normalidade, em discordância com outros trabalhos que citam valores até duas vezes maiores em eritrócitos de pacientes com anemia falciforme. A caracterização do polimorfismo do complexo gênico da globina ?s associada ao estudo do efeito protetor de flavonoides sobre o estresse oxidativo em eritrócitos de pacientes de anemia falciforme abre novas perspectivas para a melhoria da qualidade de vida destes pacientes, incluindo o tratamento terapêutico e nutracêutico com antioxidantes.

Abstract: Sickle cell disease stems from a genetic alteration that leads to structural disorders of hemoglobin, erythrocyte membrane protein, and oxidative stress. The aim of the present work was to correlate the hematological parameters with the oxidative status and protective action of flavonoids in red cells of patients with sickle cell anemia in their haplotypes. We studied 29 patients with sickle cell anemia (SS) attended at the center of Hematoterapy and Hematology of Paraná (HEMEPAR), undergoing therapy with hydroxyurea (0.5 to 1.0 g/day) and 15 individuals considered normal (AA group). It were determined the haplotypes of the cluster ?-globínico and the concentration of fetal hemoglobin (FHb) in patients with sickle cell anemia. The formation of reactive oxygen species (ROS), percentage of hemolysis, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), reduced glutathione (GSH), methemoglobin and glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6-PD) were analyzed in the basal state and under the action of two oxidizing agents (t-BHP and AAPH). It was observed in the studied population the predominance of the BAN haplotype (70%) compared to BEN (25.8%), in agreement with other studies carried out in Brazil in States in which there was slave traffic from the same regions of Africa. It was found one patient with the SEN haplotype. In the SS group, the basal fetal hemoglobin was high (10.9 ± 8.2%); there has been greater tendency to oxidation demonstrated by the formation of methemoglobin in basal state (AA = 3.44±0.38; SS = 4.45±1.10%), and under the action of t-BHP (1mmole/l) (AA = 5.52±1.77; SS = 10.15±4.12%); TBARS after action of t-BHP (2 mmole/l) (AA = 177.13±76.44; SS = 374.18 ± 144.08 nmole/gHb); there were no changes in the levels of GSH in the basal state (AA = 7.94±1.38; SS = 7.78±2.29 mU/gHb), but there was consumption of GSH after action of t-BHP (2 mmol/l) (AA = 0.50±0.36; SS = 1.02 ± 0.84 ?mole/gHb). There was also increased activity of G6-PD in the basal state (AA = 6.39±0.90; SS = 13.01±4.75 mU/gHb) and its higher consumption after addition of t-BHP (3 mmol/l) (AA = 4.99±0.70;SS = 5.25±2.84 mU/gHb). In subgroups formed by BAN BEN/genotypes (n = 11), BAN BAN/(n = 15) and BEN/BEN (n = 2) no significant differences was found in oxidative behavior. At concentrations that ranged from 30 to 200 ?mole/l, the flavonoids quercetin, rutin, hesperidin, and miricetin were efficient in protecting against formation of ROS, TBARS, and hemolysis, but not have shown effectiveness in protecting against oxidative stress by examining the levels of GSH consumption, methemoglobin, and G6-PD activities, without differences among the subgroups studied. The results indicated a tendency to exacerbation of oxidative process in erythrocytes of patients with sickle cell anemia, without differences between subgroups of BAN/BEN/BAN BAN and BEN/BEN. However, the patient's genotype erythrocytes SEN/SEN showed signs of increased resistance to oxidative stress. The flavonoids have protected erythrocyte membrane against oxidative stress (quercetin > rutina > miricetin > hesperidin) as verified by the values of the ERO, TBARS and hemolysis. The results obtained for methemoglobin, GSH, and G6-PD did not indicate the same protection, which could be explained by the small penetration of the same in the cell cytosol. By comparing the results to the subgroups, it was not observed behavioral differences, and one cannot indicate the genetic variability as a factor that has influenced. The use of hydroxyurea may have influenced the results found in this work, since the formation of ROS was compatible with normality, in disagreement with other authors mentioning values up to two times higher in erythrocytes of sickle cell anemia patients. Genotypic characterization associated to the study of the protective effect of flavonoids on oxidative stress of erythrocytes in patients with sickle cell disease opens new prospects for the improvement of the quality of life of these patients, including therapeutic and nutraceutical treatment with antioxidants.