Imunomodulação com o anticorpo monoclonal anti-CD45RB no transplante de Ilhotas de Langerhans em camundongos
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Data
2000Autor
Freitas, Alexandre Coutinho Teixeira de
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Resumo: Este estudo tem por objetivo avaliar a modulação do sistema imune com três doses do anticorpo monoclonal anti-CD45RB administradas no período peritransplante em modelo de aloenxerto de ilhotas de Langerhans de camundongos BALB-c sob a capsula do rim esquerdo de camundongos C57BL-6 diabéticos por estreptozocina. Os animais foram divididos em 5 grupos: isoenxertos sem tratamento (grupo I, n=10); aloenxertos controle (grupo II, n=8); aloenxertos tratados com anti-CD45RB (grupo III, n=17); aloenxertos tratados com o anticorpo monoclonal anti-CTLA4 (grupo IV, n=8); aloenxertos tratados com anti-CD45RB e anti-CTLA4 (grupo V, n=13). Rejeição foi considerada quando a glicemia era maior que 200 mg/dl. Os animais que apresentaram rejeição e os dos grupos I e III que atingiram o 120° dia de pós-operatório foram nefrectomizados no lado esquerdo. Os animais do grupo III que apresentaram hiperglicemia apos a nefrectomia no 120° dia de pós-operatório foram submetidos a 2° transplante com ilhotas de camundongos BALB/c ou CBA/H sob a capsula do rim direito e nefrectomizados e sacrificados apos 50 dias de funcionamento ou quando apresentaram rejeição. Todos os enxertos foram avaliados histologicamente por hematoxilina e eosina. Os enxertos dos animais dos grupos I e III no 120° dia de pós-operatório e do grupo III no 50° dia de pós-operatório do 2° transplante foram avaliados também por imuno-histoquimica para insulina. Três animais dos grupos II a V foram nefrectomizados a esquerda, esplenectomizados e sacrificados no 7o dia de pós-operatório. Os rins com os enxertos foram avaliados histologicamente por hematoxilina e eosina. Os leucócitos foram separados do restante do tecido esplênico, e os linfócitos T CD4 avaliados por citometria de fluxo quanto a expressão de CD45 e CTLA4. Todos os isoenxertos funcionaram ate o 120° dia de pos-operatorio. Os aloenxertos dos grupos II e IV apresentaram rejeição entre o 10° e o 15° dia. Sete aloenxertos do grupo III tratados com anti-CD45RB funcionaram ate o 120° dia quando foram submetidos a um 2o transplante. Três dos 4 animais que receberam um 2o enxerto de camundongos BALB/c não apresentaram rejeição ate o 50° dia e 3 animais que receberam um 2° enxerto de camundongos CBA/H apresentaram rejeição entre o 10° e o 15° dia. O aumento da sobrevida dos enxertos induzido pelo anticorpo monoclonal anti-CD45RB foi dependente dos estímulos negativos da molécula CTLA4, pois o bloqueio dessa molécula no grupo V causou rejeição entre o 15° e o 25° dia de pós-operatório em todos os animais. A analise histológica demonstrou infiltrado monomorfonuclear com destruição da arquitetura dos enxertos em todos os animais que apresentaram rejeição e infiltrado monomorfonuclear ao redor do enxerto sem invadir o seu interior nos animais dos grupos II, III, IV e V no 7o dia de pós-operatório, nos animais dos grupos I e III no 120° dia e nos animais do grupo III no 50° dia de pós-operatório do 2o transplante, nesses três últimos grupos com positividade para insulina na imuno-histoquimica. A analise por citometria de fluxo mostrou aumento do numero de linfócitos T CD4 expressando CD45 de baixo peso molecular e CTLA4 intracelular e diminuição no numero de linfócitos T CD4 apresentando CD45 de alto peso molecular nos animais tratados com o anticorpo monoclonal anti-CD45RB em relação aos controles. Conclui-se que o predomínio de linfócitos T CD4 expressando CD45RB de baixo peso molecular e CTLA4 intracelular, que e regulador negativo da ativação linfocitária, esta associado ao aumento da sobrevida dos enxertos e a indução de tolerância imunológica nos animais tratados com o anticorpo monoclonal anti-CD45RB. Abstract: The aim of this study is to analyse the immunomodulation with 3 doses o f anti- CD45RB monoclonal antibody given in the peritransplant period of BALB/c mice islets of Langerhans allografts under the left kidney capsule of streptozocin induced C57BL-6 diabetic mice. There were 5 groups o f mice: isografts with no treatment (group I, n=10); allografts with no treatment (group II, n=8); allografts treated with anti-CD45RB (group III, n=17); allografts treated with the monoclonal antibody anti-CTLA4 (group IV, n=8); allografts treated with anti- CD45RB and anti-CTLA4 (group V, n=13). Glucose levels higher than 200mg/dl were considered rejection. Animals with rejection o f the grafts and group I and III animals with no rejection after 120 days of the transplant were nephrectomized on the left side. Hiperglicemic group III animals after the nephrectomy at 120 days were transplanted again with BALB/c or CBA/H mice islets under the capsule o f the right kidney and, after 50 days or when presented with rejection, they were nephrectomized on the right side and sacrificed. All grafts were analysed w ith hematoxilin and eosin. Group I and III grafts working after 120 days and group III grafts 50 days after the 2° transplantation were analysed also with immunohistochemistry for insulin. Three animals on groups II to V were esplenectomized, nephrectomized and sacrificed 7 days after the transplant. The kidneys containing the grafts were analyzed with hematoxilin and eosin. Leukocytes were separated from the splenic tissue and CD45 and CTLA4 expression were determined on CD4 T cells with flow cytometry. All isografts were working after 120 days. Group II and IV animals rejected the grafts after 10 to 15 days. Half o f group III allografts were working after 120 days when they were submitted to the second transplantation. Three o f the 4 animals that received a 2nd BALB/c graft didn't presented rejection until 50 days after the transplantation and the 3 animals that received a CBA/H graft presented rejection after 10 to 15 days. Anti-CD45 induced increased graft survival depended on negative CTLA4 molecule signals since CTLA4 blockade on group V caused rejection on all animals after 15 to 25 days. Histology showed destruction o f the architecture o f the islets with a mononuclear cell infiltrate in all rejected grafts and a perislet mononuclear cell infiltrate with no islet invasion on groups II, III, IV and V 7 days after the transplantation, group I and III grafts 120 days after the 1st transplant and group III grafts 50 days after the 2nd transplant, the 3 last groups with positive insulin staining on immunohistochemistry. Flow cytometry showed an increased number o f CD4 T cells expressing CD45RB of low molecular weight with intracellular CTLA4 and a decreased number of CD4 T cells expressing CD45RB o f high molecular w eight on animals o f group III in relation to the controls. In conclusion, the increased number o f CD4 T cells expressing CD45RB o f low molecular weight with intracellular CTLA4, a negative regulator of T lymphocyte activation, is associated with the increased survival and tolerance induction on animals treated with anti- CD45RB monoclonal antibodies.
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