Banco de sementes e sistemas de propagação in vitro como estratégia de conservação para Bulbophyllum peri Schlt. e Epidendrum secundum Jacq.

Abstract

Resumo: Neste trabalho o objetivo principal foi estabelecer estratégias de conservação ex situ para as espécies Epidendrum secundum e Bulbophyllum peri. Sementes sem armazenamento e armazenadas a -20°C por quatro, oito e doze meses, de ambas as espécies, tiveram suas viabilidades testadas por meio de testes de germinação in vitro em quatro meios de cultura (MS, MS/2, WPM e KC). Para E. secundum também foram testadas concentrações de BAP (0,55; 1,10 e 2,20 ?M) no meio KC e para B. peri foi testado pré-resfriamento das sementes sem armazenamento por 21 dias a 8°C. Após subcultivos em meio WPM, as plântulas se desenvolveram e foram aclimatizadas em três substratos: Plantmax florestal® e vermiculita (1:2), sphagnum e fibra de coco (2:1) e carvão e fibra de coco (2:1). O melhor meio de cultura foi o WPM para ambas as espécies. As sementes sem armazenamento de E. secundum apresentaram 100% de germinação em meio WPM e à medida que as sementes foram armazenadas houve perda da viabilidade, constatada pela redução da germinação (73,8% após doze meses) e redução dos índices de crescimento e de velocidade de germinação. No melhor meio de cultura (WPM) as sementes sem armazenamento de B. peri praticamente não germinaram (7%). Quando submetidas ao pré-resfriamento, a germinação aumentou (40%), porém, a melhor porcentagem de germinação (56,5%) foi encontrada após quatro meses de armazenamento, ocorrendo diminuição da viabilidade após oito e doze meses. Foi constatado que não é necessário adicionar BAP para a germinação de E. secundum e que B. peri apresenta dormência que pode ser superada pelo tratamento de pré-resfriamento. Na fase de aclimatização o melhor substrato para ambas as espécies foi Plantmax florestal® e vermiculita (1:2), que proporcionou maior porcentagem de sobrevivência para E. secundum (100%) e B. peri (35%). Para a indução de estruturas semelhantes à protocormos destas espécies, foram utilizadas folhas jovens e mais velhas e protocormos sem o ápice foliar. Os explantes foram inoculados em meio WPM com concentrações de BAP (entre 1 e 40 ?M de BAP) e diferentes regimes de luz (escuro ou metade do tempo de cultivo no escuro seguido de fotoperíodo 16 horas). Em ambas as espécies os explantes mais responsivos foram os protocormos sem o ápice, seguidos das folhas mais jovens e folhas mais velhas. Para B. peri, após 90 dias de cultivo, as folhas foram pouco responsivas, sendo que os melhores resultados para folhas jovens (6% de explantes com formação de estruturas semelhantes a protocormos (ESPs) e uma média de 5,0 por explante) ocorreram na concentração de 5 ?M de BAP e no regime de escuro, seguido de fotoperiodo de 16h e dos protocormos (94% de explantes responsivos e 5,9 ESPs por explante) foi com a concentração de 20 ?M de BAP. Para a espécie E. secundum após 60 dias os resultados foram melhores, as folhas mais novas formaram 2,0 ESPs por explante e cerca de 70,4% dos explantes foram responsivos na concentração de 1 ?M de BAP, em regime de escuro, seguido de fotoperíodo de 16 horas. Para os protocormos a melhor concentração foi de 1 ?M de BAP com 100% de explantes responsivos e 4,4 ESPs por explante. A multiplicação in vitro foi eficiente a partir de protocormos, com a adição de BAP ao meio de cultura.A análise anatômica demonstrou a regeneração direta dos ESPs a partir de camadas epidérmicas e sub-epidérmicas. Bancos de sementes destas espécies são indicados para a conservação ex vitro, porém mais testes devem ser realizados em relação ao tempo de armazenamento superior a doze meses e temperaturas abaixo de -20°C.

Abstract: In this work the main objective was to establish ex situ conservation strategies for the species Epidendrum secundum and Bulbophyllum peri. Fresh and stored seeds at -20 °C for four, eight and twelve months had their viability tested by in vitro germination tests on four different media (MS, MS / 2, and KC WPM). E. secundum were also tested concentrations of BAP (0.55, 1.10 and 2.20 ?M) in the KC medium and for B. Peri was tested pre-chilling of fresh seeds for 21 days at 8 °C. After subcultures on WPM medium, the plantlets developed and acclimatization was carried out in three substrates: Plantmax florestal® and vermiculite (1:2), coconut fiber and sphagnum (2:1) and charcoal and coconut fiber (2:1). The best culture medium was WPM for both species. The fresh seeds of E. secundum showed 100% germination in WPM medium and there was loss of viability of stored seeds, evidenced by the reduction of germination (73.8% after twelve months) and reduced growth rates and velocity germination index. In the best culture medium (WPM) the fresh seeds of B. peri virtually did not germinate (7%). When subjected to the pre-chilling, germination increased (40%), however, the best germination percentage (56.5%) was found after four months of storage and from eight to twelve months, decreased viability was observed. It has been found that it is not necessary to add BAP for the germination of E. secundum and B. peri has dormancy that can be overcome by the treatment of pre-chilling. In the acclimatization phase the best substrate for both species was Plantmax florestal® and vermiculite (1:2), which showed higher percentage of survival for E. secundum (100%) and B. peri (35%). For the induction of protocorm-like bodies of these species, we used young and older leaves and protocorms with timmed leaf apex. The explants were inoculated in WPM medium with different BAP concentrations (between 1 and 40 ?M BAP) and different light regimes (dark or half the time of culture in the dark followed by 16 hours photoperiod). In both species, the explants most responsive explants were protocorm with timed leaf apex, followed by young leaves and older leaves. To B. peri, after 90 days of cultivation, the leaves were unresponsive, and the best outcomes for young leaves (6% of explants with formation of PLBs and an average of 5.0 per explant) occurred at a concentration of 5 ?M of BAP and in the dark, followed by a 16 h photoperiod. For the protocorms (94% of explants responsive PLBs and 5.9 per explant) the 20 ?M concentration of BAP was the best. For E. secundum after 60 days the results were better, the younger leaves formed 2.0 per explant PLBs and about 70.4% of the explants were responsive to the concentration of 1 mM of BAP in the dark, followed by 16-hour photoperiod. For protocorms the best concentration was 1 ?M of BAP with 100% responsive explants and 4.4 per explant PLBs. In vitro multiplication is efficient from protocorms, with the addition of BAP medium, allowing the large scale production of plants. Anatomical analysis showed the direct regeneration of PLBs from epidermal layers. Seed banks of these species are reliable for conservation ex vitro, but more tests should be performed in relation to storage time exceeding twelve months and temperatures lower than -20°C.