Caracterização estrutural e bioquimica das glandulas produtoras de veneno de Loxosceles intermedia( aranha marron )

Abstract

Resumo: O presente trabalho teve como objetivo, estudar, a morfologia das glândulas produtoras de veneno da aranha L intermedia, bem como esclarecer questões relacionadas ao perfil e funções dos oligossacarídeos conjugados às glicoproteínas deste veneno. A aranha marrom, do gênero Loxosceles, tornou-se de grande importância médica, devido aos acidentes de envenenamento (loxoscelismo) que vem ocorrendo em diferentes partes do mundo. As atividades biológicas do veneno da aranha marrom normalmente incluem lesões dermonecróticas no local da picada, acompanhadas por efeitos hemolíticos e hemorrágicos e também pelo quadro clínico de insuficiência renal aguda (IRA). Pelo uso de microscopia óptica, microscopia eletrônica de transmissão e de varredura, demonstrou-se que a organização das glândulas produtoras de veneno de Loxosceles intermedia seguem a arquitetura geral das glândulas de veneno de outras aranhas. A microscopia eletrônica de varredura mostrou que as glândulas de veneno são estruturas pares, situadas no cefalotórax e que descarregam seus produtos de secreção diretamente em um par de tubos ligados a cada quelícera. Usando-se microscopia óptica e microscopia eletrônica de transmissão, observou-se que as glândulas apresentam camadas de fibras de músculos estriados, em contato com uma membrana basal que separa a região muscular da camada epitelial. As células epiteliais possuem um citoplasma rico em retículo endoplasmático rugoso, mitocôndrias, complexo de Golgi e vesículas secretoras contendo o veneno, uma mistura complexa de proteínas. Com as técnicas de lectina-blotting, cromatografia de afinidade lectínica e tratamentos com glicosidases, detectou-se no veneno estruturas do tipo alta-manose N-ligadas, proteínas com resíduos de fucose N-Iigados e proteínas com resíduos de N-acetilgalactosamina O-ligados, mas ausência de glicosaminoglicanos ou estruturas complexas contendo galactose ou ácido siálico terminais. Com veneno deglicosilado enzimática ou quimicamente, demonstrou-se que a agregação plaquetária (atividade trombocitopênica), como também os efeitos fibronectinolítico e fibrinogenolítico (hemorrágicos), são açúcar-independentes quando comparados com os efeitos do veneno glicosilado. Uma análise através de zimograma copolimerizado em géis de gelatina, mostrou que a loxolisina B, uma metaloprotease gelatinolítica de 32-35 kDa, é uma glicoproteína do tipo alta-manose e que após uma N-deglicosilação enzimática teve seu peso molecular reduzido em aproximadamente 2 kDa e seu efeito gelatinolítico residual em 28%, quando comparado com a molécula glicosilada. Nesta condição apontou também uma atividade gelatinolítica dependente da glicosilação pós-traducional. O tratamento químico ou enzimático do veneno de L. intermedia (deglicosilação), reduziu significativamente seu efeito dermonecrótico quando testado experimentalmente em coelhos. Este dado sugere fortemente que resíduos de oligossacarídeos exercem um importante papel nos efeitos lesivos do veneno da aranha marrom e abre a possibilidade de se postular uma terapia tópica das lesões cutâneas, baseada em carboidratos.

Abstract: The objective of the present study was to describe the morphology of the venom glands of L. intermedia, and to study the profile and functions of the oligosaccharides in the proteins of the referred venom. The brown spider, genus Loxosceles, is becoming of great medical importance, with envenomation (Loxoscelism) occurring throughout the world. The biological activities of the brown spider venom usually include dermonecrotic lesions at the bite site accompanied by hemolytic and hemorrhagic effects and also by renal failure. Through light microscopy, transmission eletron microscopy and scanning eletron microscopy, it was demonstrated that the organization of the venom gland of Loxosceles intermedia follows the general architeture of spiders' venom glands. Scanning electron microscopy showed that the venom glands are paired organs located in the céphalothorax, which discharge their secretions directly via a duct to each chelicera. Using light microscopy and transmission electron microscopy we observed that the venom glands of L. intermedia present layers of striated muscle fibers in touch with an extracellular matrix which is a basement membrane structure separating the muscular region from epithelial cells of the venom gland. This structure has a cytosol extremely rich in rough endoplasmic reticulum, mitochondria, Golgi apparatus and secretory vesicles that ultimately produce the venom, a complex protein mixture. Using lectin-immunolabeling, lectin-affinity chromatography, glycosidases and proteinase-K treatments we were able to identify in venom several proteins as N- glycosylated and bearing high-mannose oligosaccharide structures, complex-type glycoconjugates as fucosylated glycans, but absence of galactose or sialic acid residues as complex sugars or glycosaminoglycan residues. Working with enzymatic or chemically deglycosylated venom we found that platelet aggregation (thrombocytopenic activity) as well as fibronectinolytic and fibrinogenolytic (haemorrhagic) effects were sugar-independent when compared to glycosylated venom. Nevertheless zymograph analysis in co-polimerized gelatin gels showed that loxolysin-B, a high-mannose glycoprotein of the venom with 32-35 kDa and gelatinolytic metalloproteinase activity, after enzymatic N-deglycosylation reduces its molecular weight by approximately 2 kDa and gelatinolytic effect to a residual activity of 28% when compared to the glycosylated molecule, pointing to post-translational glycosylation dependent gelatinolytic effect. Analysis of the chemically or enzymatically N-deglycosylated venom for its dermonecrotic effect detected only residual activity when compared with the glycosylated control. Thus, the present report suggests oligosaccharide moieties playing a role in destructive effects of brown spider venom and opens a possibility for a carbohydrate-based therapy.