Show simple item record

dc.contributor.advisorMitchell, David Alexanderpt_BR
dc.contributor.authorLima, Valéria Marta Gomes dept_BR
dc.contributor.otherUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciencias Biológicas. Programa de Pós-Graduaçao em Bioquímicapt_BR
dc.contributor.otherKrieger, Nadia, 1952-pt_BR
dc.contributor.otherFontana, José Domingos, 1944-pt_BR
dc.date.accessioned2012-09-10T17:15:57Z
dc.date.available2012-09-10T17:15:57Z
dc.date.issued2012-09-10
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/1884/27980
dc.description.abstractEste trabalho teve por objetivo a purificação e a caracterização cinética da lipase selecionada de Bacillus megaterium e a verificação do seu potencial para utilização em biocatálise em meio de solventes orgânicos. Dentre 36 cepas microbianas selecionadas para o screening inicial, a cepa de Bacillus megaterium CCOC P2637 apresentou a mais alta atividade lipolítica, tanto em placas de Petri, como em fermentação líquida (33 U/mL), tendo sido avaliada com relação ao seu potencial para utilização em biocatálise pela caracterização cinética e de estabilidade do extrato bruto e da lipase purificada. Para produção da enzima, o microrganismo foi cultivado em meio contendo sais, extrato de levedura e 1% de óleo de oliva, com incubação a 29 °C e 120 rpm. Após 72 h de cultivo, o sobrenadante foi separado das células por centrifugação e a enzima foi precipitada diretamente do sobrenadante de cultura pela adição de sulfato de amônio (80%), ressuspendida e dialisada, resultando no extrato bruto utilizado nos ensaios seguintes. O extrato bruto apresentou atividade frente a triacilgliceróis com cadeias entre 4 e 18 carbonos e frente a ésteres de pnitrofenila, destacando-se a maior atividade frente ao palmitato de p-nitrofenila. A temperatura para atividade máxima foi de 55 °C, sendo que a enzima foi razovelmente estável a 60 °C, mantendo 77% do valor inicial após 10 min de incubação. A estabilidade em solventes orgânicos foi estudada por incubação (1h, 30 °C) do extrato bruto em butanol, tolueno, hexano, heptano, isooctano e em várias porcentagens (de 25 a 100%) de acetona, etanol e isopropanol em água. O extrato bruto manteve 100% da atividade inicial nos solventes hidrofóbicos e foi surpreendentemente ativado na presença de porcentagens crescentes de etanol, isopropanol e acetona. A verificação da capacidade de catálise da enzima no sistema de micelas reversas AOT/n-heptano mostrou que as mais altas atividades específicas foram obtidas em W0 ([H2O]/[AOT]) 5 (111 U/mg) e 10 (104 U/mg) e a razão entre a atividade no meio orgânico e aquoso (Ro/a) foi de 1,9, indicando uma maior atividade no meio micelar do que no meio aquoso. Análises preliminares do extrato bruto por cromatografia de gel permeação indicaram que a enzima estava presente na forma de um agregado de alta massa molar. Com o tratamento do extrato bruto com CHAPS 1% (m/v) e aplicação em coluna Phenyl Sepharose Fast Flow obteve-se um fator de purificação de 70 e 18% de recuperação de atividade, observando-se 3 bandas de 32, 50 e 60 kDa na eletroforese SDS-PAGE. Como segunda estratégia de purificação, utilizou-se o tratamento do extrato bruto com isopropanol 30% (v/v), coluna Octyl Sepharose CL4B e eluição com isopropanol 60% (v/v). O fator de purificação obtido foi de 46, com recuperação de 86% da atividade e 3 bandas de 31, 52 e 63 kDa. Apenas a banda de 31 kDa apresentou atividade frente ao MUFbutirato, sendo que sua seqüência amino-terminal demonstrou 93% de homologia com a seqüência interna de uma colesterol esterase de Pseudomonas cepacia. A enzima purificada mostrou-se surpreendentemente mais estável do que o extrato bruto, apresentando atividade máxima em temperatura de 55-65 °C e na faixa de pH entre 6 a 9. A enzima foi estável a 50 °C, mantendo 50% da atividade após 86 min e entre pH 3 e 10,5, por 1h a 29 °C. Estes resultados mostram que a lipase de B. megaterium é uma enzima ainda não descrita na literatura, cujas propriedades cinéticas e de estabilidade são de grande interesse para aplicações em biocatálisept_BR
dc.format.mimetypeapplication/pdfpt_BR
dc.languagePortuguêspt_BR
dc.subjectBioquímicapt_BR
dc.subjectLipasept_BR
dc.subjectBacillus (Bacteria)pt_BR
dc.subjectTesespt_BR
dc.titleProduçao e purificaçao da lipase de Bacillus megaterium CCOC-P2637 e sua aplicaçao em biocatálise em solventes orgânicospt_BR
dc.typeTesept_BR


Files in this item

Thumbnail

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record