Avaliação e aperfeiçoamento de diferentes métodos para o diagnóstico da dengue

Abstract

Resumo: A dengue tornou-se, na última década, a mais importante arbovirose em temos de morbidade e mortalidade, afetando, aproximadamente, 100 milhões de pessoas ao ano. A doença é causada por um vírus de RNA cadeia simples, o qual é transmitido através da picada de mosquitos do gênero Aedes, presentes ao longo de toda a região tropical e subtropical do mundo. Uma vez que não existem vacinas contra a dengue e seus sintomas são semelhantes aos de outras doenças, um método diagnóstico rápido e confiável é fundamental para o controle efetivo de epidemias. Os principais métodos diagnósticos utilizados atualmente são os ensaios imunoenzimáticos de captura de IgM (MAC-ELISA) e a detecção do RNA virai através de RT-PCR. A eficiência dessas duas técnicas, no entanto, é variável e depende da qualidade dos reagentes e do protocolo utilizado. A fim de contribuir para a melhoria das técnicas de diagnóstico atualmente utilizadas no Brasil, desenvolveu-se esse trabalho, cujos principais objetivos foram: 1) obter antígenos específicos e a um baixo custo, capazes de substituir antígenos produzidos em cérebro de camundongo, utilizados em um teste de MAC-ELISA desenvolvido no Brasil; 2) estabelecer um protocolo de PCR em tempo real para detectar o RNA do vírus da dengue em amostras de soro humano, utilizando como protótipo o sorotipo 1 do vírus (DEN1). Os antígenos usados no teste de MAC-ELISA foram produzidos em cultivo celular e foram testados utilizando-se 50 soros de indivíduos suspeitos de infecção por dengue. Os resultados foram comparados com os do teste original. Apenas dois resultados discordantes foram obtidos. A análise dessas duas amostras por uma terceira técnica (dot-blot) confirmou os resultados obtidos com o antígeno feito em cultura, sugerindo que este, além de ser mais facilmente produzido, é mais sensível e específico. Os dois testes sorológicos detectaram um número maior de amostras positivas entre os soros coletados após o sétimo dia de início dos sintomas. O protocolo de PCR em tempo real desenvolvido nesse trabalho foi comparado com um protocolo de nested PCR descrito na literatura. Ambos os testes foram avaliados quanto sua sensibilidade e especificidade utilizando RNA de vírus da dengue dos sorotipos 1 (DEN1) e 2 (DEN2) e de vírus da febre amarela. A nested PCR foi capaz de detectar o RNA proveniente de 2x102 FFU/ml, enquanto que a sensibilidade da PCR em tempo real foi inferior a 6,25x10"1 FFU/ml. A PCR em tempo real para DEN1 não foi capaz de amplificar amostras de DEN2, mas detectou como positivas as amostras de febre amarela, o que não ocorreu na nested PCR. O mesmo painel de soros testado por ELISA foi submetido às duas técnicas de PCR e os resultados obtidos foram comparados. A baixa sensibilidade da nested PCR foi confirmada pela baixa taxa de detecção observada quando RNAs extraídos diretamente dos soros foram usados na reação. Quando os soros foram passados em cultura celular antes da extração do RNA, porém, o número de amostras positivas aumentou consideravelmente, indicando que essa etapa é importante para o melhor funcionamento dessa técnica. A maior sensibilidade da PCR em tempo real parece compensar, no entanto, esse problema. As duas técnicas de PCR detectaram um número maior de amostras positivas entre os soros coletados antes do sétimo dia após o início dos sintomas, indicando que os métodos moleculares são complementares aos testes sorológicos e as duas abordagens devem, portanto, ser utilizadas em conjunto a fim de garantir um diagnóstico preciso. Além disso, os resultados até o momento obtidos sugerem que, devido sua maior sensibilidade e simplicidade, a PCR em tempo real é mais apropriada, do que a nested PCR, para o diagnóstico da dengue.

Abstract: Dengue is today the most important arthropod-borne viral disease and affects over one hundred million people each year. The disease is caused by a RNA virus, which is transmitted by the bite of infected mosquitoes of the genus Aedes, present all over the tropical and subtropical regions of the world. To date, vaccines are not available and the control of the disease depends strongly on the control of the vector and the availability of diagnostic services in the areas of transmission. Currently, the main approaches used for dengue diagnosis are the identification of specific antibodies in the patient's serum by MAC-ELISA (IgM antibody-capture enzymelinked immunosorbent assay) or the detection of viral RNA by reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR). The efficiency of those two techniques, however, depends on the quality of the reagents and the protocol utilized. The main objectives of this work were: 1) to obtain specific antigens in a low cost way, able to replace those produced in mouse brain currently used in a MAC-ELISA test developed in Brazil; 2) to establish a protocol for real time PCR to detect dengue virus RNA in human serum samples, utilizing as a prototype the serotype 1 of the virus (DEN1). The dengue antigens for the MAC-ELISA were produced in culture cells and evaluated using the sera of 50 suspected cases of dengue infection. The results were compared to those obtained by the test performed with the original antigen. Only two discordant results were noticed. The analysis of those two samples by a third technique (dot blot) confirmed the results obtained with the antigens produced in cell culture, suggesting that they are more sensitive and specific than the mouse brain extract. Both of the serological tests detected a larger number of positive samples among those collected after the seventh day of the onset of the symptoms. The real time PCR protocol developed in this work was initially evaluated using RNA from dengue virus serotype 1 (DEN1), serotype 2 (DEN2), and yellow fever virus. The sensitivity and specificity of a nested RT-PCR described before were also evaluated in the same manner. The nested PCR was able to detect the RNA originating from 2x102 FFU/ml, while the sensitivity of the real time PCR was lower than 6,25x10"1 FFU/ml. The real time PCR was not able to amplify samples of DEN2, but detected as positive the yellow fever samples; it did not occur with the nested PCR. The same panel of serum used in the ELISA was submitted to the two PCR techniques and the results obtained were compared. The lower sensitivity of the nested PCR was confirmed by the low rate of detection observed when RNAs extracted directly from serum samples were used. However, when the virus were amplified in cell culture prior to RNA extraction, the positive number increased, indicating that such procedure is essential for this technique. The higher sensitivity of the real time PCR seems to compensate, in part, this problem. For the two PCR based techniques the detection of viral RNA were greater among the samples collected before the seventh day after the onset of the disease. These results suggest that the MAC-ELISA should be used in conjunction with an RT-PCR approach in order to improve the efficiency of dengue diagnosis. In addition, the real time PCR seems to be more suitable for the dengue diagnosis since it's more sensitive and easier to perform than the nested PCR.