Desenvolvimento de ensaio in vitro para avaliar a potência neutralizante de soro antiloxoscélico de uso terapêutico

Abstract

Resumo: O loxoscelismo e uma sindrome necrotico-hemolitica causada por acidentes com pequenos aracnideos, popularmente chamados de aranhas marrons, pertencentes ao genero Loxosceles. Os acidentes representam um importante problema de saude publica na America do Sul, onde predominam as especies L. intermedia, L. gaucho e L. laeta. A terapia, ainda controversa, apresenta diversos protocolos, sendo o soro antiveneno o unico tratamento especifico. Sua eficacia (potencia) e determinada pela capacidade de neutralizacao do efeito dermonecrotico do veneno (L. intermedia) atraves de testes em coelhos, processo indispensavel na liberacao para uso terapeutico. Estes procedimentos sao trabalhosos, demorados e sacrificam grande numero de animais. Assim, o presente estudo teve como objetivos propor e desenvolver metodos in vitro para auxiliar na qualificacao de soros antiloxoscelicos de equideos hiperimunes. A tecnica de ELISA foi empregada, na qual soros de diferentes potencias, previamente qualificados in vivo, foram testados frente a diversos antigenos (pool de venenos, L. intermedia e/ou proteina dermonecrotica recombinante LiD1). No entanto, nao foi possivel estabelecer uma relacao direta entre titulos obtidos pelo metodo e a potencia neutralizante dos soros. Optou-se pelo mapeamento e estudo de epitopos de toxinas dermonecroticas usando o metodo de Spot, no qual membranas contendo peptideos que cobrem toda a sequencia de aminoacidos da principal toxina (fosfolipase-D) representativa de cada um dos venenos das tres especies de Loxosceles (L. intermedia, L. gaucho e L. laeta) foram testadas frente aos soros de diferentes potencias. Os soros reconheceram epitopos de diferentes regioes das proteinas, alem disso, foi visto que o reconhecimento de alguns epitopos era recorrente apenas em soros de alta potencia quando testados em elevada diluicao. Com base nesses resultados, dois peptideos (5 e 7) foram selecionados, sintetizados, acoplados a albumina bovina serica (BSA) e utilizados em um teste in vitro no formato de ELISA indireto. Diferentes condicoes foram testadas, nas quais a composicao (Pep5-BSA, Pep7-BSA ou PeP5+7-BSA), a concentracao de antigenos nas placas, assim como a diluicao dos soros foram variadas. A melhor condicao encontrada para a qualificacao dos soros, ou seja, na qual houve distincao estatisticamente significativa (p<0,05) entre as amostras de alta e baixa potencia foi a utilizacao do peptideo 5 na concentracao de 25 ƒÊg/mL e os soros em diluicao 1:1000. Os resultados obtidos permitem sugerir que o teste ELISA usando epitopos sinteticos como antigeno pode ser usado na avaliacao da potencia neutralizante de antivenenos, pois a utilizacao de peptideos sinteticos permitiu a correlacao da reatividade dos soros apresentada no imunoensaio com o seu potencial neutralizante.

Abstract: Loxoscelism is a necrotic-hemolytic syndrome caused by accidents with small arachnids, popularly known as brown spiders, belonging to the genus Loxosceles. The accidents represent a major public health problem in South America, where the predominant species are L. intermedia, L. gaucho and L. laeta. Therapy, although controversial, has several protocols and the antivenom serum is the only specific treatment. Its effectiveness (potency) is determined by the capacity of neutralizing the dermonecrotic effect of the venom (L. intermedia) which is evidenced through tests in rabbits, an essential process to release the serum for therapeutic use. These procedures are laborious, time consuming and a large number of animals are sacrificed. Thus, the aims of this study are to propose and develop in vitro methods to assist in qualifying anti-loxoscelic equine hyperimmune sera. The ELISA technique was employed, in which sera of different potency, previously qualified in vivo, were tested against various antigens (pool of venoms, L. intermedia and / or LiD1 recombinant dermonecrotic protein). However, it was not possible to establish a direct relation between titers obtained by the method and the neutralizing potency of the sera. We chose for the mapping and study of the epitopes of dermonecrotic toxins using the Spot method, in which membranes containing peptides covering the entire amino acid sequence of the major toxin (phospholipase-D) representative of each of the venoms of the three species Loxosceles (L. intermedia, L. gaucho and L. laeta) were tested against sera of different potencies. The sera recognized epitopes from different regions of the proteins, in addition, it was found that the recognition of some epitopes was recurring only in high potency serum when tested in high dilution. Based on these results, two peptides (5 and 7) were selected, synthesized, coupled to bovine serum albumin (BSA) and used in an in vitro assay with an indirect ELISA format. Different conditions were tested, in which the composition (Pep5-BSA, Pep7-BSA or PeP5+7-BSA), the antigen concentration in the plates, as well as the dilution of the sera were varied. The best condition found for the qualification of the sera, or in which distinction was statistically significant (p <0.05) between samples with high and low potency, was the use of the peptide 5 at a concentration of 25 ?g/mL and sera at 1:1000 dilution. The results obtained allow us to suggest that the ELISA test using synthetic epitopes as antigens can be used in the evaluation of the neutralizing potency of antivenoms, because the use of synthetic peptides has allowed the correlation of the reactivity of sera presented in the immunoassay with its neutralizing potential.