Desenvolvimento de ensaio in vitro para avaliar a potência neutralizante de soro antiloxoscélico de uso terapêutico

Abstract

Resumo: O loxoscelismo e uma sindrome necrotico-hemolitica causada por acidentes com pequenos aracnideos, popularmente chamados de aranhas marrons, pertencentes ao genero Loxosceles. Os acidentes representam um importante problema de saude publica na America do Sul, onde predominam as especies L. intermedia, L. gaucho e L. laeta. A terapia, ainda controversa, apresenta diversos protocolos, sendo o soro antiveneno o unico tratamento especifico. Sua eficacia (potencia) e determinada pela capacidade de neutralizacao do efeito dermonecrotico do veneno (L. intermedia) atraves de testes em coelhos, processo indispensavel na liberacao para uso terapeutico. Estes procedimentos sao trabalhosos, demorados e sacrificam grande numero de animais. Assim, o presente estudo teve como objetivos propor e desenvolver metodos in vitro para auxiliar na qualificacao de soros antiloxoscelicos de equideos hiperimunes. A tecnica de ELISA foi empregada, na qual soros de diferentes potencias, previamente qualificados in vivo, foram testados frente a diversos antigenos (pool de venenos, L. intermedia e/ou proteina dermonecrotica recombinante LiD1). No entanto, nao foi possivel estabelecer uma relacao direta entre titulos obtidos pelo metodo e a potencia neutralizante dos soros. Optou-se pelo mapeamento e estudo de epitopos de toxinas dermonecroticas usando o metodo de Spot, no qual membranas contendo peptideos que cobrem toda a sequencia de aminoacidos da principal toxina (fosfolipase-D) representativa de cada um dos venenos das tres especies de Loxosceles (L. intermedia, L. gaucho e L. laeta) foram testadas frente aos soros de diferentes potencias. Os soros reconheceram epitopos de diferentes regioes das proteinas, alem disso, foi visto que o reconhecimento de alguns epitopos era recorrente apenas em soros de alta potencia quando testados em elevada diluicao. Com base nesses resultados, dois peptideos (5 e 7) foram selecionados, sintetizados, acoplados a albumina bovina serica (BSA) e utilizados em um teste in vitro no formato de ELISA indireto. Diferentes condicoes foram testadas, nas quais a composicao (Pep5-BSA, Pep7-BSA ou PeP5+7-BSA), a concentracao de antigenos nas placas, assim como a diluicao dos soros foram variadas. A melhor condicao encontrada para a qualificacao dos soros, ou seja, na qual houve distincao estatisticamente significativa (p<0,05) entre as amostras de alta e baixa potencia foi a utilizacao do peptideo 5 na concentracao de 25 ƒÊg/mL e os soros em diluicao 1:1000. Os resultados obtidos permitem sugerir que o teste ELISA usando epitopos sinteticos como antigeno pode ser usado na avaliacao da potencia neutralizante de antivenenos, pois a utilizacao de peptideos sinteticos permitiu a correlacao da reatividade dos soros apresentada no imunoensaio com o seu potencial neutralizante.