Efeitos da Hispidulina sobre o metabolismo oxidativo e a viabilidade de células de Hepatoma Humano (HepG2)

Abstract

Resumo: O carcinoma hepatocelular (CHC) e a mais comum neoplasia maligna primaria do figado em todo o mundo, com opcoes limitadas de tratamento. Os flavonoides sao um grupo de compostos polifenolicos com muitas atividades biologicas, incluindo propriedades antitumorais. Embora os efeitos antitumorais de alguns flavonas ja estao descritos em alguns tipos de tumores, os efeitos da hispidulina 5,7,4'-tri-hidroxi-6-metoxiflavona) em celulas de hepatoma humano HepG2 ainda nao foram descritas. Assim, os objetivos desse trabalho foram em celulas de CHC avaliar os efeitos da hispidulina sobre: a) viabilidade celular; b) ciclo celular c) niveis de especies reativas de oxigenio (ERO) intracelular; d) viabilidade na presenca de N-acetilcisteina; e) niveis de glutationa e f) expressao das enzimas antioxidantes. Atraves do metodo do MTT verificou-se que hispidulina e capaz de reduzir a viabilidade celular das celulas HepG2 de maneira dependente da dose e do tempo, observando-se uma reducao de 24%, 45% e 53% nas doses de 50, 100 e 200 ƒÊM respectivamente apos 24 horas de incubacao; 36%, 51% e 68% respectivamente apos 48 h e 60%, 82% e 91% respectivamente apos 72 h de tratamento. Para avaliar alteracoes no ciclo celular, realizou-se um ensaio utilizando citometria de fluxo, onde observou-se que apos tratamentos com hispidulina (50 e 100 ƒÊM, 24 h) houve um aumento da fase subG1 de 69% e 93% respectivamente, assim como uma diminuicao de 13% e 20% nas mesas doses na fase G1. Para avaliar os niveis de especies reativas de oxigenio (ERO) utilizou-se a sonda DCFH-DA e foi constatado que apos tratamento com hispidulina (50 e 100 ƒÊM) por 24 horas houve um aumento de 49% e 61% respectivamente, apos 48 horas o aumento foi de 55% e 122%, e apos 72 horas o aumento foi de 92% e 177% respectivamente. O aumento dos niveis de ERO pode gerar um dano oxidativo a membrana mitocondrial e esse dano pode levar a morte celular por apoptose. Para confirmar o envolvimento do aumento de ERO na inducao de morte celular, realizou-se a analise da viabilidade (MTT) na presenca de hispidulina com um tratamento simultaneo com um antioxidante (N-acetilcisteina - NAC) e verificou-se que apos tratamento com a hispidulina (50 ƒÊM, 24 h) houve uma reducao de 28% na viabilidade celular, quando adicionou-se NAC nas concentracoes de 5 e 10 mM, estas reducoes foram de 22% e 14% respectivamente. Apos o tratamento com hispidulina (100 ƒÊM) a reducao de viabilidade foi de 36%, porem com a adicao de NAC 5 e 10 mM essas reducoes foram de 23% e 17% respectivamente quando o dobro da concentracao de NAC (10 mM) foi utilizado, indicando que a adicao de NAC protege contra a morte celular. Nos experimentos para avaliar os niveis de glutationa total (GSH) e a relacao GSH/GSSG, utilizou-se analise espectrofotometrica e observou-se uma diminuicao significativa dos niveis de GSH de 43% e 52% apos o tratamento com a hispidulina (50 e 100 ƒÊM, 24 h). Foi visto tambem uma diminuicao de 36% e 46% respectivamente na relacao GSH/GSSG, o que indica uma diminuicao das defesas antioxidantes celulares. Os niveis de ERO tambem podem ser afetados pelas atividades de enzimas antioxidantes, para essa analise utilizando-se RT-PCR, foi possivel observar que os niveis de mRNA da enzima catalase diminuiram significativamente em 38 e 40% nas doses de 50 e 100ƒÊM respectivamente. Conjuntamente, os resultados parecem indicar que a hispidulina pode ter um potencial para novos estudos visando o tratamento do carcinoma hepatocelular.

Abstract: Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common primary malignancy of the liver in the world, with limited therapeutic options. Flavonoids are a group of polyphenolic compounds with many biological activities, including antitumor properties. While the antitumor effects of some flavones are already described in some types of tumors, the effects of hispidulin (5,7,4 '-trihydroxy-6-methoxyflavone) in HepG2 human hepatoma cells have not been described. The objectives of this study were in HCC cells to evaluate the effects of hispidulin on: a) cell viability b) cell cycle c) levels of reactive oxygen species (ROS) intracellular, d) viability in the presence of N-acetylcysteine; e) levels of glutathione and f) expression of antioxidant enzymes. By the MTT method it was found that hispidulin is capable of reducing cell viability of HepG2 cells in a manner dependent on dose and time, observing a reduction of 24%, 45% and 53% at doses of 50, 100 and 200 ìM, respectively, after 24 hours of incubation, 36%, 51% and 68% after 48 hours and 60%, 82% and 91% respectively after 72 h of treatment. To assess alterations in cell cycle, a test was carried out using flow cytometry, where it was observed that after treatment with hispidulin (50 and 100 ìM, 24 h) an increase in the phase subG1 69% and 93% respectively, and as a decrease of 13% and 20% tables doses in G1 phase. To assess the levels of reactive oxygen species (ROS) used the probe DCFH-DA and it was found that after treatment with hispidulin (50 and 100 ìM) for 24 hours there was an increase of 49% and 61% respectively after 48 hours, the increase was 55% and 122% after 72 hours and increased by 92% and 177% respectively. The increased levels of ROS can cause oxidative damage to mitochondrial membrane and this damage can lead to cell death by apoptosis. To confirm the involvement of reactive oxygen species increase in the induction of cell death, there was consideration of the viability (MTT) in the presence of hispidulin with simultaneous treatment with an antioxidant (N-acetylcysteine - NAC) and it was found that after treatment with the hispidulin (50 ìM, 24 h) there was a 28% reduction in cell viability when NAC was added at concentrations of 5 and 10 mM, these reductions were 22% and 14% respectively. After treatment with hispidulin (100 ìM) the reduction of viability was 36%, but with the addition of NAC (5 e 10 mM) these reductions were 23% and 17% respectively when twice the concentration of NAC (10 mM) was used, indicating that the addition of NAC protects against cell death. In experiments to assess the levels of total glutathione (GSH) and GSH / GSSG, spectrophotometric analysis was used and there was a significant decrease in GSH levels of 43% and 52% after treatment with hispidulin (50 and 100 ìM, 24 h). It has also been a decrease of 36% and 46% respectively in the GSH / GSSG ratio, which indicates a decrease in cellular antioxidant defenses. The levels of ROS can also be affected by the activities of antioxidant enzymes, for this analysis using RT-PCR, we observed that the mRNA levels of catalase significantly decreased in 38 and 40% at doses of 50 and 100 ìM respectively. Together, the results seem to indicate that hispidulin may have a potential for new studies to the treatment of hepatocellular carcinoma.