Análise da expressão dos genes do metabolismo de nitrato nas estirpes SMR1 e DCP286A de Herbaspirillum Seropedicae por PCR em tempo real

Abstract

Resumo: O presente trabalho teve como objetivo quantificar a expressão de genes responsáveis pelo metabolismo de nitrato em H. seropedicae, estirpes SmR1 e DCP286A (ntrC-), por PCR quantitativo em tempo real. A quantificação dos níveis de expressão nas estirpes SmR1 e DCP286A demonstraram que o transportador de nitrato NasFED tem sua expressão dependente de nitrato, possivelmente controlada pela proteína NtrC e ativação dependente da proteína NasR. Os genes narK1UnarGHJI estão organizados em um operon e sua expressão depende de NtrC, da proteína FNR e ainda da proteína NarL. Os genes narKnirBDCnasA também estão organizados em um operon e sua expressão possivelmente está sob o controle de NtrC e de NasR. A expressão genes do sistema de dois componentes narXL parece ser dependente de NtrC, porém os sítios promotores encontrados são fracos. A expressão do gene nasR ainda não está clara, porém a presença de grampos terminadores de transcrição sugerem uma possível auto-regulação. A expressão do gene ntrY na estirpe SmR1 se demonstrou constitutiva e a diminuição da expressão na estirpe DCP286A sugere uma possível dependência da proteína NtrC para expressão de ntrY, porém os dados obtidos não são suficientes para elucidar o papel deste gene no metabolismo de nitrato em H. seropedicae.

Abstract: The aim of this work is to study the regulation of nitrate metabolism genes of the diazotrophic bacterium Herbaspirillum seropedicae. Previous work showed that the mutant strain DCP286A (ntrC) is unable to grow using nitrate, indicating that that the ntrC gene is crucial for the regulation of nitrate metabolism. The expression levels of the genes narK, nasA, nirD, narU, narG, nasF, ntrY, nasR and narX were determined in the wild type and DCP286A (ntrC) strains of H. seropedicae grown in the presence of nitrate (10 mM) or ammonium chloride (20 mM).The expression levels were normalized by the expression of the 16S rRNA gene. The results showed that the genes nasF, narK, nasA, nirD, narU, narG are strongly induced by nitrate in the wild type strain but not in the ntrC strain, confirming the role of NtrC in activating the expression of nitrate utilization genes. Sequence analysis of the promoter region of nasFED operon revealed an NtrC and an RpoN binding sites, and a termination hairpin, suggesting that the regulation of the nasFED operon in H. seropedicae is mediated by the NtrC and the anti-terminator NasR proteins. The expression of the narX was also upregulated by nitrate, but at lower extent. In contrast nasR seems to be self-regulated and ntrY expression was neither regulated by nitrate or depedent on NtrC.