Desenvolvimento de um bioprocesso para a produção, caracterização e recuperação da Fitase de Schizophyllum Commune obtida por fermentação em estado sólido

Abstract

Resumo: As fitases hidrolisam o acido fitico em inositol e fosfatos, os quais se encontram armazenados em graos, sementes e legumes. Fitases podem ser produzidas por processos de fermentacao submersa (FSm) ou fermentacao no estado solido (FES). A FES e a mais vantajosa, pois pode utilizar residuos agroindustriais como substrato/suporte, os quais apresentam baixo custo e possuem elevado rendimento de producao final. As fitases apresentam aplicacoes em racao animal e produtos para consumo humano. Estas melhoram a absorcao do fosforo, de outros nutrientes no organismo e tambem reduzem a quantidade de fosforo eliminado nos excrementos dos animais resultando em beneficios para o meio ambiente. O presente trabalho teve como objetivo otimizar a producao da enzima fitase de S. commune por FES utilizando o farelo de trigo como substrato/suporte, caracterizar, recuperar a fitase produzida, estudar a extracao liquido-liquido da fitase alem de estudar a sua estabilidade durante o armazenamento. O basidiomiceto Schizophyllum commune foi selecionado como um produtor de enzima fitase utilizando o farelo de trigo como substrato/suporte para a producao de fitase. Para a otimizacao da producao de fitase foi realizado um planejamento experimental fatorial fracionado Box-Behncken design 35 utilizando cinco variaveis independentes (temperatura, concentracao de sacarose, concentracao de extrato de levedura, pH e taxa de inoculo) em tres niveis (+1, 0, -1) e cinco pontos centrais totalizando 37 experimentos. A producao maxima de fitase (113,76 U/gbs) foi obtida com o meio suplementado com sacarose 5%, pH 7, taxa de inoculo 7,5% e temperatura de fermentacao de 33 ‹C. Esse resultado aumentou 285% a producao de fitase em 72 horas de fermentacao. A fitase apresentou uma atividade otima em pH 5 e temperatura de 50 ‹C, Km e Vmax de 0,16 mM e 1,85 ƒÊmol/mL.min respectivamente. A fitase foi ativada na presenca de K+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Na+ acetato e citrato e completamente inibida por molibdato de amonio. A melhor condicao de armazenamento para a manutencao da estabilidade da enzima sob refrigeracao (4 ‹C) com 22% de atividade relativa em 125 dias. Estudos preliminares com estabilizantes no extrato bruto enzimatico foram realizados apontando o aditivo A (0,25% p/v) como o melhor agente estabilizante o qual mantem 109% de atividade relativa durante 90 dias de armazenamento a temperatura ambiente de 25 ‹C. A extracao liquido-liquido da enzima utilizando as condicoes de concentracao de citrato 14% (m/m), massa molar de PEG 1500, concentracao do PEG 22% (m/m) e pH 7 tambem apresentou um resultado satisfatorio, com recuperacao de 367 %, fator de purificacao de 5,43 e coeficiente de particao de 2,63.

Abstract: Phytases hydrolyze phytic acid to inositol and phosphates, which are stored in grains, seeds and vegetables. Phytases can be produced by submerged fermentation (SmF) and solid-state fermentation which is most used and commercially advantageous. It can use agroindustrial residues as substrate/support, which reduces the cost of the bioprocess and the final price of the enzyme. Phytases have applications in feed and products for human consumption. Phytases improve phosphorus absorption and others nutrients and also reduce the amount of phosphorus eliminated in the animals excrements resulting in benefits to the environment. This study aimed to optimize the phytase production of S. commune by SSF, characterize, recovery the produced phytase, study the liquid-liquid extraction and the stability during storage. The basidiomycete Schizophyllum commune was selected as a major of phytase producer using wheat bran as substrate/support for the phytase production. The optimization of phytase production was carried out by a full 35 fractional factorial Box-Behnken experimental designs using five independent variables (temperature, sucrose concentration, yeast extract concentration, pH and inoculum rate) at two levels (+1, 0, -1) and five central points totalizing 37 experiments. The maximal level of phytase (113.76 U/gds) was obtained in a medium containing sucrose 5%, pH 7.0, inoculum rate 7.5% at 33ºC during 72 hours. This result increased 285% the phytase production in 72 hours fermentation. The enzyme had an optimum pH 5 and 50°C, Km and Vmax of 0.16 mM and 1.85 mmol / mL min, respectively. The enzyme was activated in the presence of K+, Ca2 +, Mg2 +, Mn2 +, Zn2 +, Cu2 +, Fe2 +, Fe3 +, Co2 +, Ni2+, Na+, acetate and citrate and completely inhibited by ammonium molybdate. The best storage condition for maintaining the enzyme stability was at 4 ° C, with 22% relative activity in 125 days. Preliminary studies with stabilizers agents in crude enzymatic extract were performed, resulting in additive A (0.25% w/v) as the best stabilizing agent with 109% relative activity during 90 days of storage at room temperature 25°C. The liquid liquid extraction of ezyme using citrate 14% (m/m), PEG 1500, PEG concentration of 22% (w/w) and pH 7 also had satisfactory results, with a partition coefficient of 2.63, yield 367% and purification factor of 5.43.