Caracterização de miosinas órfãs de Trypanossoma cruzi (Chagas, 1909)

Abstract

Resumo: Miosinas são motores moleculares envolvidas com diferentes formas de movimentação celular, como fagocitose, citocinese, contração muscular, batimento de cílios e tráfego de organelas e partículas. Elas usam a energia derivada da hidrólise do ATP para realizar esses movimentos e possuem um domínio motor comum. A diversidade dos membros da família nos permite agrupá-las em classes. A miosina muscular foi definida como convencional (classe 2), enquanto outros tipos são referidos coletivamente como miosinas não-convencionais (agrupadas em várias classes). Miosinas que filogeneticamente não se agrupam com qualquer outra miosina são denominadas miosinas órfãs. T. cruzi possui, além dos genes que codificam para duas miosinas (uma presente em quase todos os organismos – classe 1 – e uma presente apenas em outros tripanosomatídeos – classe 13), outros sete genes identificados que codificam para miosinas órfãs, chamadas de MyoA, MyoB, MyoC, MyoD, MyoE , MyoF, MyoG, que são o foco deste trabalho. Para iniciar a caracterização destas miosinas, experimentos foram delineados visando elucidar a localização celular e as proteínas que interagem com as miosinas. Para alcançar estes objetivos foi necessária a expressão de proteínas recombinantes para a produção de anticorpos em camundongos que foram utilizados para ensaios de imunolocalização e imunoprecipitação. Em paralelo, a transfecção do parasita para a expressão da proteína fusionada ao GFP e identificação da sua localização foi realizada. Os resultados nos confirmam que cinco das sete miosinas identificadas in silico são encontradas nos extratos protéicos das formas epimastigotas do parasita, mas que essa expressão deva ocorrer em baixos níveis. A localização celular visualizada através da utilização de anticorpos foi realizada para a MyoC, MyoD e MyoE. As miosinas C e E se concentram na região anterior do parasita, compatível com a bolsa flagelar e base do flagelo respectivamente e a miosina D tem uma localização granular dispersa pelo citoplasma. As demais miosinas tiveram sua localização visualizada somente quando expressas fusionadas à etiqueta de GFP, através da captação da fluorescência da etiqueta. A maioria dessas localizações apresentaram um padrão disperso pelo corpo celular, com exceção da MyoF que apresentou uma localização filamentar concentrada da porção anterior do parasita. Estamos trabalhando para identificar as proteínas que possam estar interagindo com as miosinas órfãs de T. cruzi. O nocaute gênico foi realizado para MyoC e ocorreu morte da cultura celular após o provável silenciamento de um dos alelos desta proteína. Estamos investigando se o hemizigoto realmente não é viável ou se não houve a adequada recombinação do cassete de resistência nessa primeira tentativa de transfecção. O estudo das miosinas de T. cruzi, suas funções e suas interações dentro da célula irá contribuir para a avaliação do papel do citoesqueleto em Trypanosoma cruzi.

Abstract: Myosins are molecular motors involved in various forms of cellular movement like phagocytosis, cytokinesis, muscle contraction, beating of cilia and trafficking of organelles and particles. They use energy derived from ATP hydrolysis to perform these movements and have a common motor domain. The diversity of the family members enables us to group them in classes. The muscle myosin was defined as conventional (class 2), whereas other types are collectively referred to as unconventional myosins (grouped in many classes). Myosins that phylogenetically do not group to any other myosin are termed orphan myosins. T. cruzi has, besides the genes coding for 2 myosins (one present in almost all organisms - class 1 - and the other present only in trypanosomatids – class 13), seven other genes identified that code for orphan myosins, called MyoA, MyoB, MyoC, MyoD, MyoE, MyoF, MyoG, which are the focus of this work. To start the characterization of these myosins, experiments were designed to elucidate the cellular localization and the proteins that interact with each myosin. To achieve this objective it was necessary to produce recombinant proteins for antibody production in mice that were used in immunolocalization and immunoprecipitation assays. In parallel, transfection of the parasite with a plasmid coding for the myosin fused to GFP and identification of their location were performed. The results confirm that five of the seven myosins identified in silico are found in the protein extract of epimastigotes parasite, but this expression occurs at low levels. The cellular localization by immunofluorescence performed for MyoC, MyoD and MyoE. The myosins C and E are concentrated in the anterior region of the parasite, compatible with the flagellar pocket and the proximal region of the flagellum, respectively and the myosin D have a granular localization throughout of the parasite cytoplasm. The other myosins had their localization identified only by their expression fused with GFP tag, by capturing the label fluorescence. The localization of all of them except MyoF showed a pattern scattered throughout the cell body; MyoF showed a concentrated localization in the anterior region of the parasite, going to the posterior end in a filament shape. We are working to identify the proteins that can be interacting with the orphan myosins of T. cruzi. The gene knockout was performed for MyoC and it occurred cell death after the probable gene silencing of one allele. We are investigating whether hemizygotes is really not viable or if there was no appropriate recombination of the resistance cassette in this first attempt transfection . The study of T. cruzi myosins, their functions and their interactions within the cell will contribute to the evaluation of the cytoskeleton role in Trypanosoma cruzi.