Seleção de biocompostos antimicrobianos produzidos por bactérias lácticas

Abstract

Resumo: O setor agroindustrial de produção de carne suína e de frango representa uma importante atividade econômica no Brasil, conta com tendências de crescimento visando suprir a crescente demanda mundial por alimentos e, ao mesmo tempo, sofre com restrições legais quanto ao uso de antibióticos durante o manejo dos animais, resultado de um mercado consumidor mais exigente. Dessa forma, este estudo teve por objetivo selecionar linhagens a partir de isolados bacterianos e leveduras com potencial para a produção de compostos inibitórios ao desenvolvimento das bactérias patogênicas Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, tipicamente responsáveis por infecções gastrointestinais em saúde animal. Fazendo uso da técnica de microdiluição em caldo, o potencial antimicrobiano foi observado inicialmente nos extratos brutos de 39 bactérias ácido-lácticas (BAL), a partir de um total de 272 linhagens avaliadas. Avaliações subseqüentes revelaram que dentre estas, dez linhagens apresentavam maior regularidade na síntese dos compostos antimicrobianos e, assim, foram selecionadas. Estudos de indução de produção envolvendo as 10 linhagens selecionadas revelaram que o isolado BAL 027 detinha os maiores percentuais inibitórios, superiores a 50% de inibição para as cinco bactérias indicadoras, e que a produção foi especialmente favorecida na fermentação em co-cultivo utilizando cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 como cultura indutora. A cinética de produção de compostos antimicrobianos revelou maior atividade ao final da fase exponencial e na fase estacionária de crescimento da cepa produtora. Foram realizados estudos complementares de caracterização da natureza e sensibilidade dos compostos ativos, que apresentaram estrutura essencialmente protéica e supostamente composta por cadeias laterais glicídicas e lipídicas, fundamentais à ação biológica. A estabilidade da biomolécula foi mantida sob pH ácido até 2,0, e parcialmente perdida sob pH alcalino (8,0 – 12,0), bem como houve perda parcial de atividade pela ação da temperatura, em valores acima de 60ºC. O tamanho molecular estimado da biomolécula foi próximo a 3,0 kDa, o que representaria um peptídeo com ação antimicrobiana. A caracterização molecular de isolados selecionados foi conduzida através da análise dos fragmentos de restrição do gene 16S(ARDRA) e reações de seqüenciamento genético. A análise dos fragmentos de restrição com a enzima HaeIII permitiu observar polimorfismo diante das 10 linhagens de BAL avaliadas, que foram divididas em dois grupos. Através do seqüenciamento genético os gêneros Lactobacillus spp. e Pediococcus spp. foram reconhecidos, sendo uma linhagem de L. plantarum correspondente a cepa BAL 027 de maior interesse nesta pesquisa.

Abstract: The agribusiness production of pork and poultry represents an important economic activity in Brazil benefitting from growth trends due to the growing global demand for food, while simultaneously suffering legal restrictions on the use of antibiotics in animal management, the result of a more demanding consumer market. Thus, this study aimed to select strains from bacterial and yeast isolates with potential for the production of compounds inhibitory to the development of the pathogenic bacteria Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, typically responsible for gastrointestinal infections in animals. Making use of broth microdilution technique, the antimicrobial potential was first observed in crude extracts of 39 lactic acid bacteria (LAB), from a total of 272 strains evaluated. Subsequent evaluations revealed that ten strains showed greater regularity in the synthesis of antimicrobial compounds and these were therefore selected. Studies involving induction of production of 10 selected strains revealed that LAB 027 had the highest inhibitory percentage, always upper than 50% of inhibition against the five sensible bacteria, and that production was especially favored in co-cultivation fermentation using a strain of Staphylococcus aureus ATCC 25923 as inducing culture. The kinetics of production of antimicrobial compounds showed greater activity at the end of the exponential phase and during the stationary growth phase of the producer strain. Additional studies were carried out on the characterization of the nature and sensitivity of the active compounds, which showed a protein structure essentially composed of glucose and lipid lateral chains, which are fundamental to biological action. The stability of the biomolecule was kept under acidic pH until 2.0, and partially lost under alkaline pH (8.0 to 12.0), and there was partially lost by the action of temperature, from 60ºC to 121ºC heating. The putative molecular size of the biomolecule was close to 3.0 kDa, possibly represented by a peptide with antimicrobial effects. The molecular characterization of selected isolates was by amplified ribosomal DNA restriction analysis 16S(ARDRA) and genetic sequencing reactions. Analysis of restriction fragments using the enzyme HaeIII enabled the observation of polymorphism in the selected strains of LAB, which were divided into two groups. Through genetic sequencing the genera Lactobacillus spp. and Pediococcus spp. were identified, with a strain of L. plantarum being of greatest interest to this study (LAB 027).