Caracterização das Enzimas Nad Sintetases (NadE1 e NadE2) de Herbaspirillum Seropedicae

Abstract

Resumo: As enzimas nicotinamida adenina dinucleotídeo sintetase (NadE) catalisam o último passo da biossíntese do cofator NAD utilizando como substratos o ATP, o ácido nicotínico adenina dinucleotídeo (NaAD) e uma fonte doadora de grupamento amino, que pode ser a glutamina ou a amônia. O interesse nessa enzima surgiu com a hipótese de uma possível relação funcional entre NadE1 e a proteína transdutora de sinal GlnB devido à conservação filogenética da proximidade física entre os genes que codificam estas proteínas. Em Herbaspirillum seropedicae o gene nadE1 encontra-se a montante do gene glnB. Em H. seropedicae foi identificado um gene homólogo a nadE1, denominado de nadE2. Os genes nadE1 e nadE2 foram amplificados por PCR e clonados no vetor pET28a; versões contendo uma fusão de 6 histidinas na porção N-terminal de NadE1 e de NadE2 foram superexpressas em Escherichia coli e purificadas através de cromatografia de afinidade usando a resina Hi-trap chelating. As proteínas purificadas foram utilizadas em ensaios de atividade enzimática in vitro. A síntese de NAD foi monitorada indiretamente adicionando a enzima álcool desidrogenase ao sistema para reduzir o NAD a NADH, que pode ser quantificado por espectrofotometria. A enzima NadE2 não apresentou atividade in vitro. NadE1 apresentou atividade específica de 1756 mU/mg e 600 mU/mg usando como fonte de grupo amino a amônia e a glutamina, respectivamente. Foram determinadas as constantes de Michaelis para os substratos ATP, glutamina, amônia e o NaAD. Os dados obtidos sugerem que NadE1 utiliza preferencialmente glutamina como fonte de grupos amino. A presença da proteína GlnB uridililada ou desuridililada ao sistema de reação não alterou a atividade de NadE1.