Caracterização da proteína TcKAP3 do cinetoplasto do Protozoário Trypanosoma cruzi

Abstract

O DNA do cinetoplasto (kDNA) dos tripanossomatídeos consiste num arranjo raro de moléculas circulares catenadas numa única rede. Esta rede é constituida por (1) dezenas de maxicírculos, que codificam para algumas subunidades de enzimas mitocondriais e rRNA num padrão criptografado (edição de RNA), e (2) milhares de minicírculos que codificam para os RNAs guias (gRNAs). Estudos em Crithidia fasciculata mostraram que proteínas associadas ao cinetoplasto (KAPs) são capazes de condensar a rede de kDNA. No entanto, pouco é conhecido sobre as KAPs de Trypanosoma cruzi, um protozoário parasita que mostra padrões distintos de condensação de kDNA durante seu complexo desenvolvimento morfogenético. Neste trabalho nós clonamos um gene de T. cruzi que codifica uma proteína, TcKAP3 (kinetoplast-associated-protein 3), expressa em todos os estágios do parasita. Tckap3 é um gene de cópia-única e é transcrito em um mRNA de 1,8 kb. Anticorpos de camundongo gerados contra a proteína recombinante reconheceram uma proteína de 25 kDa em epimastigotas que está associada ao cinetoplasto. Várias características de TcKAP3 tal como seu tamanho pequeno, natureza básica e a similaridade com CfKAP3, são coerentes com um papel na neutralização de carga e na condensação do DNA, sugerindo que esta proteína possa estar envolvida na organização da rede de kDNA. Mutantes de T. cruzi para Tckap3 são capazes de diferenciar in vitro sem perda da capacidade infectiva e não apresentam modificações na estrutura e morfologia do cinetoplasto.

The kinetoplast DNA (kDNA) of trypanosomatids consists of an unusual arrangement of two types of circular molecules catenated into a single network: (1) A few maxicircles, that encode for some subunits of mitochondrial enzymes and rRNA in a cryptic pattern, and (2) thousands of minicircles that encode for the guide RNA (gRNAs). Studies in Crithidia fasciculata showed that the kDNA is associated with proteins, known as kinetoplast-associated proteins (KAPs), which are capable of condensing the kDNA network. However, little is known about the KAPs of Trypanosoma cruzi, a parasitic protozoon that shows distinct patterns of kDNA condensation during their complex morphogenetic development. In this work we have cloned a gene of T. cruzi which encodes the protein TcKAP3 (kinetoplast-associated protein 3). Tckap3 is a single-copy gene that is transcribed into a 1.8 kb mRNA and expressed in all stages of the parasite. Mouse antiserum raised against the recombinant TcKPA3 recognized a 25 kDa protein which was found, by indirect immunofluorescence, to be associated with the kinetoplast of T. cruzi. Several features of TcKAP3 such as its small size, basic nature and similarity with CfKAP3, are consistent with a role in DNA charge neutralization and condensation, suggesting that this protein could be involved in organizing the kDNA network. Gene deletion was used to investigate the function of TcKAP3. Tckap3 null mutants can differentiate in vitro without losing their infective capacity, with no modification in the structure and morphology of kinetoplast.