Expressao e purificaçao da proteína GInD de Herbaspirillum seropedicae

Abstract

Resumo: O Herbaspirillum seropedicae é um diazotrofo endofítico encontrado dentro de raízes, caules e folhas de diversas gramíneas de interesse agrícola. Essa bactéria é capaz de fixar nitrogênio atmosférico sob condições microaeróbicas e na ausência de amônio. Em H. seropedicae o sistema Ntr participa da regulação da expressão da proteína NifA, ativadora transcricional dos genes responsáveis pela fixação de nitrogênio atmosférico. A proteína GlnD possui um papel chave na regulação do sistema Ntr atuando como um sensor dos níveis de nitrogênio intracelular e controlando o estado de uridililação da proteína GlnB, uma das proteínas envolvidas na cascata de regulação da fixação de nitrogênio. O gene glnD foi amplificado a partir do DNA genômico do H. seropedicae utilizando oligonucleotídeos sintetizados. A seqüência do gene glnD de H. seropedicae foi obtida do Banco de Dados do Projeto de Sequenciamento Genômico do H. seropedicae - GENOPAR (Programa Genoma do Paraná). O fragmento amplificado foi clonado no vetor pGEM-T e subclonado nos vetores de expressão pET28b(+) e pET29a(+) originando os plasmídeos pGH1 e pGH2, capazes de superexpressar a proteína GlnD ligada a uma cauda N-terminal de histidinas (GlnD-His) e na sua forma nativa (GlnD), respectivamente. As condições de expressão das proteínas GlnD e GlnD-His na estirpe duplo-mutante glnB' e glnD' de E. coli RB9065(ÀDE3) foram otimizadas. Para aumentar a quantidade de proteína solúvel foi investigado o efeito de diferentes fatores na composição do tampão de lise das células. A proteína GlnD-His foi purificada por cromatografia de afinidade numa coluna de afinidade (HiTrap- Chelating-Ni+2) em uma única etapa. A proteína GlnD nativa foi parcialmente purificada por cromatografia de troca aniônica (DEAE-Sepharose) em um sistema de FPLC.