Avaliaçao do medicamento homeopático imunomodulador em células de medula óssea de camundongos tratados in vitro e in vivo

Abstract

O microambiente da medula óssea é composto de fatores de crescimento, células estromais, matriz extracelular e células progenitoras, que se diferenciam em células sanguíneas. Estudos prévios demonstraram que o medicamento imunomodulador homeopático complexo Canova (IH) aumentou o número de leucócitos. Nesse trabalho relatamos o efeito do tratamento sobre as células mononucleares, tanto in vitro quanto in vivo. Quatro grupos foram realizados: a) tratado com o medicamento IH; b) tratado com IH e M-CSF; c) apenas com M-CSF como controle positivo; d) e sem nenhum tratamento. Os fêmures de camundongos suíços foram dissecados, limpos e as células da medula óssea foram lavadas. Foram então plaqueadas, tratadas ou não, incubadas em diferentes tempos e processadas para microscopia de luz e eletrônica de transmissão. A imunofenotipagem e as citocinas foram analisadas por citometria de fluxo. O medicamento aumentou o número de nichos e de células com núcleo em anel (precursoras). Microscopia de luz e eletrônica de transmissão mostraram diferentes estágios de maturação com células residentes e ativadas. Com o tratamento houve um acentuado aumento no volume celular, número de mitocôndrias, do retículo endoplasmático granular e do complexo de Golgi. Todas as técnicas de microscopia mostraram que a linhagem monocítica (CD11b+) e as células estromais (aderentes) foram ativadas com o tratamento. O medicamento aumentou os "clusters" (nichos celulares) sobre as células aderentes, sugerindo áreas de proliferação. As análises exvivo mostraram que o número de núcleos em anel, nichos celulares e macrófagos ativados aumentaram nas culturas tratadas. O tratamento permitiu a sobrevivência e diferenciação dessas células, provavelmente produzindo citocinas e fatores de diferenciação. Esses resultados podem ser de fundamental importância para tratamentos clínicos em medicina regenerativa e terapias celulares.

The bone marrow microenvironment is composed of growth factors, stromal cells, extracellular matrix and progenitor cells which differentiate into mature blood cells. Previous studies demonstrated that an immunomodulator complex homeopathic drug called Canova (IH) induced up-regulation in leukocytes count. We now report the effect of the "in vitro" and "in vivo" IH treatment on the mononuclear cells lineage of the bone marrow. Four groups were performed: a) treated with the IH drug; b) with IH plus MCSF; c) with M-CSF only, as positive control; d) and without any treatment. Swiss mice femurs were dissected, cleaned and the cells of the marrow were flushed. The cells were plated, treated or not, incubated for different periods and processed for light and transmission electron microscopy analysis. Immunophenotyping and cytokines were analyzed by flow cytometer. An increase in the numbers of the cell niches and ringshaped nuclei cells (progenitors) was observed in treated group. Light and transmission electron microscopy showed the stages of monocyte maturation, with resting and activated cells. A marked increase in cell volume was observed under treatment as well as, an increase in the number of mitochondria, expansion of the RER and an enlargment were observed in Golgi apparatus. All microscopy techniques showed that a monocytic lineage (CD11b+) and stromal cells (adherent cells) were activated by treatment. IH also increased cell clusters over adherent cells, suggesting the presence of proliferation areas. The ex vivo analysis showed that the number of ring nuclei, niches cells, as well as activated macrophages increased in culture. The treatment allowed the survival and differentiation of these cells, probably inducing cytokines and growth factors production. These results may be of fundamental interest in clinical treatments, regenerative medicine and cellular therapies.