Efeitos do estresse sobre componentes alternativos da cadeia respiratória e na transiçao de permeabilidade em mitocôndrias de tubérculos de batata e caracterizaçao de mitocôndrias de Araucaria angustifolia

Abstract

Mitocôndrias de tubérculos de batata tratados pelo frio foram isoladas com o intuito de comparar os efeitos deste estresse com mitocôndrias de tubérculos não tratados. Este tratamento aumentou a sensibilidade da NADH desidrogenase externa - localizada na face externa da membrana mitocondrial interna - ao mersalil, mas não alterou os efeitos estimulatórios provocados pelo Ca2+. Não foram observados efeitos do mersalil, diamida ou Ca2+ sobre o consumo de O2 quando o substrato era o succinato. A diamida inibiu a oxidação de NADH e succinato em mitocôndrias de batata somente na presença de cianeto, indicando a ação sobre a oxidase alternativa (AOX). Houve inibição da AOX na presença de Ca2+ durante a oxidação de succinato e NADH, mostrando uma possível regulação da enzima pelo íon. O inchamento mitocondrial induzido por Ca2+ mostrou–se mais evidente após o tratamento dos tubérculos pelo frio. Houve proteção por DTT, EGTA e catalase nas situações de estresse e sem estresse, indicando que grupamentos SH, Ca2+ e espécies reativas de O2 (ERO), estão envolvidos no fenômeno de transição de permeabilidade mitocondrial (TPM) em ambas as situações. O inchamento provocado por Ca2+ e/ou mersalil foi impedido pela presença de SHAM, mesmo em mitocôndrias de tubérculos não estressados, mostrando que o efeito protetor observado não está relacionado com sua capacidade de inibir a AOX e sim, com suas propriedades de quelação aos íons ferro. Neste trabalho também foram isoladas pela primeira vez mitocôndrias de calos de Araucaria angustifolia e assim obtidas mitocôndrias capazes de respirar pela oxidação dos substratos malato / glutamato, NADH e succinato, com alta capacidade fosforilativa, demonstrada pelos controles respiratórios e Dy. Ao contrário das mitocôndrias de batata, mitocôndrias isoladas de calos de Araucaria angustifolia foram capazes de captar Ca2+ de modo sensível ao vermelho de rutênio e dependente do potencial elétrico de membrana e fosfato. Houve também efluxo do ion tanto pelo reverso da via de influxo, pela adição de FCCP, como pela via de efluxo com vermelho de rutênio. Estas mitocôndrias foram capazes de oxidar NADH externamente adicionado na presença de rotenona, e apresentaram um consumo de O2 insensível ao cianeto e sensível ao SHAM, indicando a presença de NADH desidrogenase externa e AOX, respectivamente. Além disso as mitocôndrias foram desacopladas pela presença de ácido graxo e ausência de BSA, sugerindo a presença de proteína desacopladora de plantas, aqui denominada Araucaria- UCP. O estudo destas mitocôndrias capazes de captar Ca2+ e isoladas de uma gimnosperma encontrada principalmente em regiões frias do sul do Brasil permitirá a comparação com mitocôndrias de angiospermas que apresentem ou não o mecanismo de transporte do íon, bem como aprofundar os conhecimentos em relação a TPM e aos efeitos de estresse pelo frio

Mitochondria were isolated from potato tubers exposed to cold temperature in order to compare the effects of this stress with unstressed tuber mitochondria. Cold treatment increased the sensitivity of the external NADH dehydrogenase – located on the external face of the internal membrane – to mersalyl, but did not alter the stimulatory effects caused by Ca²+. There were no effects caused by mersalyl, diamide or Ca²+ on the oxygen consumption when the substrate was succinate. Diamide inhibited the oxidation of NADH and of succinate in potato mitochondria only when in the presence of cyanide, indicating an action on the alternative oxidase (AOX). The results showed that Ca²+ presented an inhibitory effect on the AOX pathway when mitochondria were energized with NADH or succinate, indicating a possible regulation of the enzyme by this ion. The mitochondrial swelling induced by Ca²+ was more evident after cold treatment of the tubers. In stressed and unstressed conditions there was protection from swelling by DTT, EGTA and catalase.This shows that thiol reagents, Ca²+ and reactive oxygen species (ROS) are involved in mitochondrial permeability transition (MPT) under both conditions. Swelling by Ca²+ and/or mersalyl was delayed when in the presence of SHAM even in mitochondria from unstressed tubers, which shows that its protective effect is unrelated to its capacity of inhibiting AOX and probably related to iron quelation. Mitochondria were also isolated for the first time from callus of Araucaria angustifolia. The mitochondria obtained were able to oxidize malate/glutamate, NADH and succinate as respiratory substrates and able to sustain a high transmembrane electrical potential. Unlike potato mitochondria, those isolated from callus of A. angustifolia were able to take up Ca²+ supported by substrate oxidation, sensitive to ruthenium red and dependent on membrane potential and phosphate. Efflux of Ca²+ by the reversal of the influx pahway occurred by addition of FCCP and by the efflux pathway by addition of ruthenium red. These mitochondria were also able to oxidize externally added NADH in the presence of rotenone, and presented oxygen consumption insensitive to cyanide and sensitive to SHAM indicating the presence of external NADH-dehydrogenase and AOX, respectively. Besides, mitochondria were uncoupled, in the absence of BSA, by the addition of the free fatty acid – oleic acid – thus suggesting the presence of the plant uncoupling mitochondrial protein, hereby denominated Araucaria-UCP. The study of these mitochondria capable of Ca²+ uptake, isolated from a gymnosperm found principally on the highlands of southern Brazil, will allow the comparison with mitochondria from angiosperms presenting or not the Ca²+ transporting mechanism. It will also increase our knowledge regarding MPT and the effects relative to cold stress.