Caracterização molecular dos genes fdxA, modB2, modE1 e modE2 de Herbaspirillum seropedicae

Abstract

Resumo: Na região a jusante dos genes estruturais da nitrogenase de Herbaspirillum seropedicae (nifHDKENXorf1orf2) estão localizados os genes fdxA (codifica uma ferredoxina do tipo 2[4Fe-4S]) e os genes nifQmodA1B1C1, relacionados com o transporte e incorporação de molibdênio em cofatores de molibdoenzimas. O gene fdxA foi mutagenizado pela inserção sítio-dirigida de um cassete lacZ-Km. Uma estirpe de H. seropedicae fdxA- foi construída e apresentou redução de 75% na atividade da nitrogenase comparada com a estirpe selvagem. O fenótipo apresentado, a localização do gene fdxA e sua cotranscrição com os genes nifHDK revelada por ensaios usando o gene repórter lacZ, sugerem o envolvimento de FdxA no transporte de elétrons para a nitrogenase ou biossíntese dos cofatores metálicos da nitrogenase. Entretanto, o produto do gene fdxA mostrou não estar envolvido no desligamento da nitrogenase em resposta à adição de íons amônio. Este resultado que contrasta com o obtido em Azoarcus onde a mutação do gene fdxN, que codifica uma ferredoxina 2[4Fe-4S], a jusante de nifENX levou a diminuição da inibição reversível da nitrogenase dependente de NH4 +. Além dos genes modA1B1C1 localizados a jusante de fdxA, a análise da sequência genômica de H. seropedicae revelou um segundo grupo homólogo aos genes envolvidos com a captação de molibdato pela célula (modA2B2C2) e dois genes do tipo modE (modE1 e modE2), possíveis reguladores transcricionais deste sistema. Mutantes no gene modB2 apresentaram atividade da nitrogenase semelhante a da estirpe selvagem e análises de expressão modB2::lacZ indicaram que este gene é transcrito em condições de limitação de molibdato no meio de cultura. As proteínas ModE1 e ModE2 foram expressas e purificadas. A proteína recombinante (His)6-ModE1 foi super-expressa como corpo de inclusão, solubilizada com uréia e renaturada em coluna durante a purificação por cromatografia de afinidade. A proteína (His)6-ModE2 foi expressa na fração solúvel e também foi purificada por cromatografia de afinidade. Essas proteínas foram analisadas quanto a capacidade de ligar na região promotora de modA2 através de ensaios de retardamento de banda em gel. As proteínas foram capazes de retardar a migração de DNA no ensaio, sugerindo a participação na regulação da expressão dos genes modABC.

In the region downstream from the H. seropedicae nitrogenase structural genes (nifHDKENXorf1orf2) are present the genes fdxA (codes for a 2[4Fe-4S] ferredoxin) and the nifQmodA1B1C1 genes, related to the molybdate incorporation and transport. The fdxA gene was mutagenized by lacZ-Km insertion and the H. seropedicae fdxA mutant strain showed 75% reduction in nitrogen fixation activity compared to the wild type strain. The fdxA is also co-transcribed with nifHDK, as shown by lacZ reporter gene fusion, suggesting the involvement of FdxA in electron transport to nitrogenase or in the biosynthesis of the nitrogenase metal cofactors. Thereafter, the product of the fdxA gene is not involved in the nitrogenase switch off/on process in response to ammonium. The genomic sequencing has revealed a second similar set genes of molybdate uptake, modA2B2C2 and two potential molybdate-dependent transcriptional regulators genes (modE1 and modE2). A modB2 mutant strain showed nitrogenase activity similar to the wild strain and the analysis of the expression of modB2::lacZ indicated that modB2 is expressed under molybdate.The proteins (ModE1 and ModE2) were expressed and purified. The recombinant His-ModE1 protein was expressed as inclusion bodies, solubilized with urea, and on-column refolded during affinity chromatography. His-ModE2 was purified by affinity chromatography from the soluble fraction. Both proteins were assayed for DNA-binding activity. The results indicated that His-ModE1 and His- ModE2 bound to modA2 promoter region, suggesting they may be involved in the regulation of the molybdate transport in H. seropedicae.