Efeitos da sidnona SYD-1 sobre alguns parâmetros metabólicos ligados à provisão de energia em células de hepatoma (HepG2) e hepatócitos

Abstract

Resumo: O carcinoma hepatocelular é uma das neoplasias malignas de maior incidência e, em relação às demais, representa a terceira causa de morte no mundo. No entanto, os medicamentos disponíveis para o seu tratamento são ineficazes, o que justifica a busca constante de novas drogas para este fim. Neste contexto, no presente estudo foram avaliados os efeitos da sidnona SYD-1 (3-[4-cloro-3-nitrofenil]-1,2,3-oxadiazólio-5-olato), que apresenta importante atividade antitumoral contra Carcinoma de Erlich e Sarcoma 180, sobre células de hepatocarcinoma humno (HepG2) e hepatócitos de rato, em suspensão e em cultivo. Ainda, investigou-se a liberação de óxido nítrico (NO?) a partir da estrutura de SYD-1, e seu envolvimento na inibição do estado 3 da respiração, efeito anteriormente atribuído ao mesoiônico. Em mitocôndrias isoladas, SYD-1 (100 ?mol.L-1) promoveu uma inibição de ~35% sobre o estado 3 da respiração, sendo esta parcialmente revertida em 14% pela adição de hemoglobina (Hb - 80 ?mol.L-1). Em sistema livre de mitocôndrias, utilizando a sonda fluorescente DAF-FM, evidenciou-se a liberação de 13,69 ± 2,67 nmol.L-1 NO?/min, a partir da estrutura de SYD-1 (3 mmol.L-1). A viabilidade de células HepG2 cultivadas, avaliada pelo método do MTT, foi diminuida pelo SYD-1 (25-100 ?mol.L-1) de maneira tempo e dose dependentes, chegando a ~96% de redução após 72h, para a maior concentração (100 ?mol.L-1). Por outro lado, o composto (25 e 50 ?mol.L-1) não afetou a viabilidade destas células em suspensão, após dois minutos de incubação, como determinado pelo método do azul de tripan. Nestas mesmas condições, SYD-1 não afetou a respiração celular, porém, promoveu a diminuição dos níveis de pirutato em ~38% e aumento dos níveis de lactato de ~17%, após 40 min de incubação (50 ?mol.L-1). Diferentemente, a respiração de células HepG2 cultivadas por 24h na presença de SYD-1 (25 e 50 ?mol.L-1) foi alterada. SYD-1 (50 ?mol.L-1) reduziu o consumo de oxigênio durante o estado desacoplado da respiração em ~26%. Nestas condições, houve uma diminuição dos níveis de piruvato em ~56% e o aumento dos níveis de lactato em ~32%. Análises morfológicas destas células mostraram sofrimento, evidenciado pela vacuolização e projeções citoplasmática (blebs) e retração celular. SYD-1 (25 e 50 ?mol.L-1) não afetou a viabilidade, avaliada pelo método do azul de tripan, como também a respiração de hepatócitos em suspensão, após 2 minutos de incubação. No entanto, a produção de piruvato foi diminuída (~36%) e a de lactato aumentada (~22%), após 40 min de incubação (50 ?mol.L-1). Já nestas células em cultura, o mesoiônico (50 ?mol.L-1) diminuiu a viabilidade, avaliada pelo método do MTT, em ~66% após 18 horas de incubação. Nestas mesmas condições, SYD-1 promoveu um aumento da liberação da enzima lactato desidrogenase (LDH) de ~83% e 257% para as concentraçoes de 25 e 50 ?mol.L-1, respectivamente. Ainda, alterações morfológicas observadas na concentração de 50 ?mol.L-1 foram sugestivas de sofrimento celular e os estados basal e desacoplado da respiração celular foram inibidos em ~79% e ~39%, respectivamente. Nestas células, a produção do piruvato e lactato foi aumentada na presença de SYD (50 ?mol.L-1) em ~83% e ~16%, respectivamente. Os resultados em mitocôndrias isoladas sugerem que o efeito inibitório do SYD-1 sobre o estado 3 da respiração seja, em parte, decorrente da liberação de NOo a partir de sua estrutura. Os efeitos sobre células HepG2 e hepatócitos sugerem que SYD-1 compromete significativamente funções metabólicas relacionadas a provisão de energia, em particular a via glicolítica e a fosforilação oxidativa e, quando considerada a menor concentração (25?mol.L-1), seus efeitos são mais pronuciados sobre as células tumorais.

Abstract: Hepatocellular carcinoma is a malignant neoplasm of high incidence and, in comparison to the other cancers, represents the third cause of death in the world. However, the drugs available for treatment are ineffective, which justify the research for new therapies . In this context, the present study evaluated the effect of SYD-1, which was shown to have important antitumor activities against Ehrlich carcinoma and Sarcoma 180, on human hepatocarcinoma cells (HepG2) and mouse hepatocytes maintained in suspension or in culture. It was also investigated the nitric oxide (NOo) release from the SYD-1 structure and it involvement in the inhibition of state 3, an effect previously described for this mesoionic. In isolated mitochondria, SYD-1 (100 ?mol.L-1) decreased the respiratory rate by ~35% during state 3, which was partially reversed (~14%) by the addition of hemoglobin (Hb - 80 ?mol.L-1). In assays using the fluorescent probe DAF-FM in a mitochondria-free system, it was verified the release of 13.69±2.67 nmol.L-1 of NOo/ min from SYD-1 (3 mmol L-1). In HepG2 cultured cells, SYD-1 (25-100 ?mol.L-1) reduced the cell viability in a time- and dose-dependent way, reaching up to 96% decreasing after 72 hours (100 ?mol.L-1), as determined by MTT method. The compound (25 and 50 ?mol.L-1) did not change the viability of these cells in suspension after two min of incubation, as determined by Trypan blue. In this condition, SYD-1 did not affect respiratory parameters of HepG2 cells. However, SYD-1 treatment (50 ?mol.L-1) decreased the levels of piruvate (~38%) and increased lactate (~17%) after 40 min of incubation. In contrast, the respiration of HepG2 cultured cells was significantly affected by incubation with SYD-1 (25 and 50 ?mol L-1) for 24 h. The compound (50 ?mol.L-1) reduced the oxygen consumption during the uncoupled state of respiration by ~ 26%. In this experimental situation, SYD-1 also promoted the reduction of pyruvate levels by ~ 56% and the increase in the lactate levels by ~32% (24h incubation at 50 ?mol.L-1). Morphological analysis of HepG2 cells in culture after treatment with SYD-1 (25 and 50 ?mol.L-1) for 24 h showed cellular injury as evidenced by the occurrence of cytoplasmic vacuolization and cell shrinking. SYD-1 (25 and 50 ?mol.L-1) did not affect the viability of hepatocytes in suspension, as evaluated by Tripan Blue, as well as respiratory parameters in these cells, after incubation for 2 min. However, the production of pyruvate was reduced (~36%) and lactate increased (~22%) after 40 min incubation with SYD-1 (50 ?mol.L-1). After 18h of incubation, the compound (50 ?mol.L-1) decreased cell viability of ~66% of cultured hepatocytes, as evaluated by MTT. At the same conditions, SYD-1 promoted an increase in the release of the enzyme lactate dehydrogenase by ~83% and ~257% for concentrations of 25 and 50 ?mol L-1, respectively. Morphological changes seen in cultured cells treated with SYD-1 (50??mol L-1) were suggestive of cell distress. Basal and uncoupled states of cellular respiration were inhibited at ~79% and ~39%, respectively, by SYD-1 (50?mol.L-1). The production of pyruvate and lactate was increased in the presence of SYD (50 ?mol.L-1) at ~83% and ~16%, respectively. The results from isolated mitochondria suggest that the inhibitory effect of SYD-1 on the state 3 is partially due to the release of NOo from its structure. In addition, SYD-1 effects on HepG2 cells and hepatocytes indicate that this mesoionic impairs metabolic functions, particularly energy-linked functions involving oxidative phosphorylation and glycolysis. At the lowest concentration (25 ?mol.L-1), SYD-1 effects are more pronounced on tumor cells.