Caracterização funcional de proteínas Poli-Q em Trypanosoma cruzi : envolvimento na regulação da expressão gênica

Abstract

Resumo: Em tripanossomatídeos, a regulação da expressão gênica ocorre principalmente em nível pós-transcricional. A associação entre mRNAs e determinadas proteínas determinam o destino de um mRNA, direcionando-o à tradução, repressão ou degradação. Para caracterizar complexos proteicos associados a mRNAs traduzidos ou não-traduzidos, um trabalho prévio isolou mRNPs de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional utilizando microesferas poli-(T) e os complexos proteicos ligados a mRNAs poli-(A+) foram analisados por espectrometria de massas. Dentre estas proteínas, uma proteína poli-Q com função desconhecida, ortóloga à TbGAP2 em T. brucei, foi identificada, presente nas frações polissomal e pós-polissomal de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional. O objetivo deste estudo é caracterizar esta proteína e determinar se esta está envolvida com a regulação da expressão gênica. O gene codificador desta proteína foi clonado e expresso para produzir anti-soro policlonal. O anti-soro contra a proteína TcGAP2 mostrou especificidade e identificou uma proteína de tamanho esperado em extratos de T. cruzi. TcGAP2 está presente no cinetoplasto e no citoplasma. Além disso, análises por Western blotting mostraram que TcGAP2 está diminuída nas formas metacíclicas, corroborando a marcação de imunofluorescência mais fraca nestas formas. Quando lisados de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional foram aplicados em gradiente de sacarose 15-55% e as frações foram analisados por imunoblotting, a proteína foi detectada em polissomos apenas nas últimas formas. Marcação in situ de nicks e gaps nas redes de minicírculos com a terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) e dUTP fluorescente seguida de imunofluorescência mostrou co-localização parcial indicando certo envolvimento com replicação de minicírculo. Para identificar mRNAs e proteínas associadas a complexos mRNPs contendo TcGAP2, foram realizados ensaios de imunoprecipitação com o soro contra TcGAP2 usando lisados de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional. Os RNAs alvo de TcGAP2 foram identificados por sequenciamento de RNA em larga escala e as proteínas, por espectrometria de massas. Os transcritos dos complexos contendo TcGAP2 mudam entre as duas formas, entretanto eles são funcionalmente relacionados, estando enriquecidos em ligação a ATP, fosforilação de proteínas, processo metabólico, dentre outros. Análises utilizando o algoritmo MEME foram realizadas para identificar motivos de sequência comuns dentre os alvos identificados. Nenhum motivo aparente foi encontrado nas regiões 3' não-traduzidas nem nas regiões codificadoras. Entretanto, dois motivos foram encontrados na região 5' nãotraduzida. Assim como os RNAs alvo mudam entre os dois estágios, as proteínas parceiras também. Algumas das proteínas identificadas em epimastigotas como parte dos complexos contendo TcGAP2 incluem proteínas ribossomais e proteínas de ligação a RNA e em epimastigotas sob estresse nutricional, várias proteínas hipotéticas. Já GAP1 foi identificada em ambas formas e, juntamente com GAP2, está envolvida com estabilização de gRNA em T. brucei. O duplo nocaute do gene de TcGAP2 não se mostrou viável sugerindo que este gene seja essencial. Estes dados sugerem que esta proteína pode ter diferentes funções dependendo de sua localização e que TcGAP2 é um componente de complexos ribonucleoprotéicos no citoplasma que podem estar regulando o processamento de mRNAs específicos.

Abstract: In trypanosomatids, regulation of gene expression occurs mainly at the posttranscriptional level. The association between mRNAs and certain proteins determine mRNA fate, directing them to translation, repression or degradation. To characterize protein complexes associated with non-translated or translated mRNAs, previous work isolated mRNPs from epimastigotes and epimastigotes under nutritional stress using poly-(T) beads and the protein complexes bound to poly-(A+) mRNAs were analysed by mass spectrometry. Among these proteins, one hypothetical poly-Q rich protein, ortholog of TbGAP2 in T. brucei, were identified, present in the polysomal and post-polysomal fractions of epimastigotes and epimastigotes under nutritional stress. The aim of this study is to characterize this protein and to determine if it is involved in gene expression regulation. The gene encoding this protein was cloned and expressed to produce polyclonal antisera. TcGAP2 antisera showed specificity and identified a protein with an expected weight using T. cruzi extracts. TcGAP2 was shown to localize in the kinetoplast and in the cytoplasm. Moreover western blot analysis was performed and showed that TcGAP2 is downregulated in metacyclic forms, corroborating the weak immunofluorescence staining in these forms. When epimastigotes and nutritionally stressed epimastigotes lysates were loaded onto a 15-55% sucrose gradient and the fractions were analysed by immunoblot, we observed that the protein was detected in polysome complexes only in the latter. In situ labeling of the nicks and gaps in network minicircles with terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) and fluorescent dUTP followed by immunofluorescence showed partial colocalization indicating some involvement with minicircle replication. To identify mRNAs and proteins associated to TcGAP2 mRNP complexes, we carried out immunoprecipitation assays with anti-GAP2 serum using epimastigotes and epimastigotes under nutritional stress lysates. The RNA targets of TcGAP2 were identified by RNA deep sequencing technology and proteins were identified by mass spectrometry. The transcripts in TcGAP2 complexes change between these two forms however they are functionally related, being enriched for ATP binding, protein phosphorylation, metabolic process, among others. MEME algorithm analysis was used to identify commonly occurring sequence motifs among the identified RNAs. No apparent motifs were found in the 3' untranslated region nor in the coding sequence. However, two motifs were found in the 5' untranslated region. As TcGAP2 RNA targets change between the two stages, protein partners also do. Some of the proteins identified in epimastigotes as part of TcGAP2 complexes include ribosomal proteins and RNA-binding proteins and in epimastigotes under nutritional stress, many hypothetical proteins. GAP1 was identified in both forms and together with GAP2 are involved in gRNA stabilization in T. brucei. Double-knockout of TcGAP2 gene was not successfully achieved suggesting that this gene is essential. These data suggest that this protein can have different roles depending on its localization and that TcGAP2 is a component of ribonucleoprotein complexes in the cytoplasm that might be regulating the processing of specific mRNAs.